練 云 王金社 魏 荷 李金英 弓貴明 王樹峰 張晶鵬 李茂林 郭建秋 盧為國,*

1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所 / 國家大豆改良中心鄭州分中心 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海油料作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河南省油料作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南鄭州 450002; 2 古交市種子服務(wù)站, 山西太原 030200; 3 洛陽農(nóng)林科學(xué)院, 河南洛陽 471023

大豆胞囊線蟲(soybean cyst nematode, SCN)病是一種世界性大豆病害, 常年給全球大豆生產(chǎn)造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。在前期調(diào)查研究中, 我們發(fā)現(xiàn)了具有超強(qiáng)致病力的大豆胞囊線蟲新生理小種X12[3](生理小種, 以下簡稱小種), 該小種的出現(xiàn)給大豆生產(chǎn)造成巨大威脅。調(diào)查X12小種分布及周圍生理小種類型, 是有目的地采取策略控制該病害發(fā)展的先決條件。

在中國兩大大豆主產(chǎn)區(qū)——東北大豆產(chǎn)區(qū)和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)均有大豆胞囊線蟲分布。前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn), 在黃淮海大豆產(chǎn)區(qū), 約有 70%的地區(qū)分布有大豆胞囊線蟲, 4號(hào)生理小種主要集中分布在山西省; 據(jù) 2012—2015年調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn), 山西省主要分布有 2號(hào)和 4號(hào)生理小種, 該小種在山西省的檢出頻率分別為38.5%和38.5%[4]。

對(duì)大豆胞囊線蟲生理小種分類目前常采用的方法有2種: Riggs和Schmitt[5]于1988年建立的將大豆胞囊線蟲劃分為16個(gè)小種模式, 以及Niblack等[6]在2002年建立的將大豆胞囊線蟲劃分為128個(gè)小種的“HG類型”模式, 其目的均是通過鑒別寄主區(qū)分致病力不同的線蟲群體。2種劃分方法各有其適宜的使用范疇, 而從抗病育種目標(biāo)出發(fā), 大豆抗病育種專家認(rèn)為劃分過細(xì)很容易給育種帶來困惑, 同時(shí),為了便于同前期調(diào)查結(jié)果進(jìn)行對(duì)比, 在中國, 相關(guān)研究專家仍采用Riggs鑒別模式。因此, 本研究也主要采用 Riggs鑒別模式對(duì)采取的土樣進(jìn)行生理小種鑒定。而隨著致病性超強(qiáng)的 X12小種出現(xiàn), 以上 2種鑒別模式所采用的寄主已不能有效將新生理小種從目前小種中區(qū)分開, 因此在生理小種鑒定中, 我們?cè)黾恿艘粋€(gè)鑒別寄主——興縣灰皮支, 用于從 4號(hào)小種中區(qū)分X12小種。

國內(nèi)外目前所用主要抗源對(duì)大豆胞囊線蟲新小種X12均表現(xiàn)感病或高感[3]。這些抗源包括Riggs鑒別模式中的4個(gè)鑒別寄主[5], HG鑒別模式中的7個(gè)鑒別寄主[6], 中國的優(yōu)異抗源興縣灰皮支(ZDD2315)[7-8]和美國目前在用的重要抗源PI437654以及用這2個(gè)抗源培育的抗病品種中黃57[3], 抗LY1線蟲群體的PI567516C[9]。在抵御由SCN給大豆生產(chǎn)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的策略中, 培育抗病品種最經(jīng)濟(jì)、有效, 然而目前缺乏抗源, 暫時(shí)限制了抗X12小種的抗病品種培育。因此, 采取輪作、化學(xué)殺蟲劑等手段對(duì)該地區(qū)SCN進(jìn)行防控尤為重要。

縱觀SCN在全球范圍大豆產(chǎn)區(qū)的危害趨勢(shì), 越來越多調(diào)查數(shù)據(jù)表明, SCN致病力正在升級(jí)且SCN擴(kuò)散范圍仍在增大。SCN 1號(hào)小種僅能夠侵染Riggs鑒別模式中的寄主 PI88788, 2號(hào)小種能夠侵染Peking、Pickett和PI88788共3個(gè)寄主, 已有研究表明, 在中國黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)及美國密蘇里州大豆產(chǎn)區(qū), 優(yōu)勢(shì)生理小種均由 1號(hào)小種[10-11]演變?yōu)?2號(hào)小種[4,12], 說明在以上 2個(gè)大豆產(chǎn)區(qū)分布的生理小種,其致病性已經(jīng)增強(qiáng)。2005年調(diào)查發(fā)現(xiàn), 在美國伊利諾伊州, 83%大豆田感染了大豆胞囊線蟲病, 其中70%感染田塊的線蟲能夠寄生于PI88788, 導(dǎo)致在該州使用現(xiàn)有抗性品種作為防治 SCN手段的有效性顯著降低[13]。隨后, 在其他產(chǎn)區(qū)也逐漸發(fā)現(xiàn)線蟲群體克服PI88788抗性, 導(dǎo)致在PI88788上的胞囊指數(shù)(female index, FI)升高[14-15]。在中國, SCN已經(jīng)擴(kuò)散到新疆、廣西、貴州等以前未受SCN侵染的大豆種植區(qū)[16-17]; 而在美國, SCN幾乎遍及所有種植大豆產(chǎn)區(qū)[14]。

SCN是一種土傳病害, 一旦大豆種植區(qū)受到侵染, 極難根除。盡管目前國內(nèi)尚未有官方數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)每年SCN給中國大豆生產(chǎn)帶來的經(jīng)濟(jì)損失, 但在前期調(diào)查過程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn), 在受到嚴(yán)重感染大豆產(chǎn)區(qū),有“火燒苗”現(xiàn)象, 比如此次調(diào)查的古交市。建議采取主動(dòng)措施對(duì)SCN進(jìn)行防治, 避免發(fā)展到大豆大面積絕產(chǎn)、損失不可挽回時(shí), 再考慮防治或重視抗病品種培育或進(jìn)行抗病品種的推廣應(yīng)用。

據(jù) 2012—2015年調(diào)查研究結(jié)果[4]發(fā)現(xiàn), 山西省是國內(nèi)大豆胞囊線蟲感染最嚴(yán)重的地區(qū), 因?yàn)橹虏×ψ顝?qiáng)的4號(hào)小種主要分布在山西省, X12就是在此次調(diào)查研究過程中于山西省古交市邢家社鄉(xiāng)采集的。2012—2015年在古交市僅取此1份土樣, 難以反映 X12小種發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)周圍生理小種分布情況; 其次, X12小種在該市其他田塊是否也有分布以及是否有擴(kuò)散現(xiàn)象, 是本研究關(guān)注的另一問題。本研究擬在前期調(diào)查研究的基礎(chǔ)上, 以邢家社為中心, 在古交市大豆種植區(qū)域密集采取土樣, 調(diào)查 X12小種周圍生理小種分布規(guī)律, 明確優(yōu)勢(shì)小種和 X12小種的分布, 以期為防治X12小種擴(kuò)散提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Riggs模式鑒別寄主[5](Lee、Peking、Pickett、PI88788和 PI90763)和興縣灰皮支由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所大豆課題組保存。

1.2 土樣采集

于2019年大豆生長期, 在山西省古交市調(diào)查大豆胞囊線蟲分布情況, 在有大豆胞囊線蟲感染地塊取土樣33份, 覆蓋7個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn), 共33個(gè)村莊, 面積810 km2。取土依據(jù)是在根系上能看到胞囊或地上部分植株出現(xiàn)明顯矮化和失綠, 采集病株周圍3～8 cm深的土層, 每份土樣20～30 kg。采集路線沿山內(nèi)屯蘭川、原平川、大川和北梁4條主干道開展。采集的樣本用塑料袋封住后, 物流到河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 保存在16℃病土儲(chǔ)存室, 直至需要檢測(cè)時(shí)取出。

1.3 生理小種鑒定

參考練云等[4]方法, 略有改動(dòng), 簡述之: (1)鑒定方式。所有采集的土樣, 直接在溫室利用Riggs模式鑒定。對(duì)于在Lee上胞囊數(shù)目少于100個(gè)胞囊/株的土樣, 種植混合的 Lee、Essex和鄭 1307擴(kuò)繁 1～2代胞囊后再通過接種進(jìn)行生理小種鑒定。(2)胞囊繁殖。將子葉出土期的感病幼苗移栽至病土中, 每杯1株, 溫室培養(yǎng), 約25 d后, 采用淘洗-過篩法將胞囊從根系上分離, 用橡皮擦輕輕研磨, 破碎胞囊, 然后將釋放出來的卵用清水懸浮, 取 10 μL在顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵密度, 備用于接種鑒定。(3)接種方法。將壤土在 150℃烘干 1.5 h, 分裝在塑料杯中, 移栽子葉出土期且生長一致的 4個(gè)鑒別寄主及 Lee、興縣灰皮支, 每杯1株, 5個(gè)重復(fù), 待長出新根后, 每杯接含2500個(gè)卵的懸浮液。25 d左右、胞囊處于顯囊盛期時(shí), 計(jì)數(shù)根部胞囊數(shù)目。

1.4 胞囊計(jì)數(shù)

將胞囊通過淘洗-過篩法從根系中分離, 利用熒光顯微鏡拍照, 結(jié)合本課題自主研發(fā)的 PDS軟件,通過計(jì)算機(jī)掃描自動(dòng)計(jì)數(shù)大豆胞囊數(shù)目, 具體方法見專利2014SR060158[18]。

1.5 數(shù)據(jù)分析及小種分布圖繪制

Lee上平均胞囊數(shù)目大于100, 認(rèn)定此次試驗(yàn)數(shù)據(jù)有效, 否則擴(kuò)繁該土樣中的胞囊, 進(jìn)行接種鑒定,如果 Lee上平均胞囊數(shù)目仍然達(dá)不到要求, 舍棄該樣本, 根據(jù)Riggs模式判別生理小種類型。FI = (待鑒定植株根系上平均胞囊數(shù)目×100/Lee根系上平均胞囊數(shù)目)。檢出頻率 = (屬某一種生理小種的樣本數(shù)目/鑒定出生理小種類型的所有樣本數(shù)目)×100%

將各采樣點(diǎn)鑒定出的小種類型, 利用統(tǒng)計(jì)分析軟件R的Maptools包[19]繪制生理小種分布圖。

2 結(jié)果與分析

在采集的 33份病土中, 共有 26份鑒定出生理小種類型, 其中15份直接利用采集的病土鑒定出生理小種類型, 另18份經(jīng)繁殖1～2代后, 通過接種進(jìn)行鑒定, 其中11份鑒定出生理小種類型, 7份由于未繁殖出足夠用于鑒定的胞囊, 故舍棄。古交市生理小種分布見圖1。

圖中所有彩色符號(hào)及灰色空心圓圈反映了受SCN感染的地塊。15份樣本鑒定為2號(hào)小種, 檢出頻率是57.7%; 11份樣本鑒定為4號(hào)生理小種, 檢出頻率是42.3% (表1); 2號(hào)和4號(hào)小種交叉分布。在鑒定為 4號(hào)生理小種的樣本中, 有 2個(gè)樣本進(jìn)一步鑒定為X12小種, 其中一份來自最初發(fā)現(xiàn)X12的采集地點(diǎn)——古交市邢家社, 在圖中用紅色實(shí)心三角形 1表示, 另一份樣本來自古交市河口鎮(zhèn), 在圖中用紅色實(shí)心三角形2表示, 這2個(gè)被檢測(cè)為X12的樣本, 在空間上有一定距離, 而且中間交叉分布有2號(hào)和4號(hào)小種, 可以排除古交市河口鎮(zhèn)的X12小種由古交市邢家社樣本感染所致; 在鑒定為 4號(hào)生理小種的樣本中, 有 3份在興縣灰皮支上的胞囊數(shù)分別為20 (FI=7.6)、46 (FI=9.6)和16 (FI=6.4), 在黃淮海生理小種鑒定中, 在興縣灰皮支上生長的胞囊數(shù)目一般在0～6個(gè) 株-1, 而且0個(gè) 株-1的占多數(shù)。這3份土樣有可能會(huì)優(yōu)先發(fā)展為X12小種。

表1 采集自古交市26份樣本的生理小種類型鑒定(2019-2020年)Table 1 Virulence phenotypes of twenty-six samples collected from Gujiao city in 2019 and 2020

(續(xù)表 1)

鑒定出生理小種類型的所有26份SCN群體, 均能夠侵染PI88788。PI88788的抗性基因是目前SCN抗性大豆品種的主要抗性來源, 說明 SCN群體在PI88788上的致病力已經(jīng)增強(qiáng), 這種現(xiàn)象在美國中北部和中國東北也有報(bào)道: 據(jù)2005年調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn),在美國伊利諾伊州, 83%大豆田感染了大豆胞囊線蟲病, 其中 70%感染田塊的線蟲能夠寄生在PI88788的根系上, 導(dǎo)致在該州使用現(xiàn)有抗性品種作為防治SCN手段的有效性顯著降低[20]; 隨后, 在美國其他大豆產(chǎn)區(qū)如密蘇里州也逐漸發(fā)現(xiàn)有部分線蟲群體克服PI88788抗性, 導(dǎo)致在PI88788上寄生的SCN胞囊指數(shù)升高[11]; 在中國東北大豆產(chǎn)區(qū), 利用單胞囊繁殖法, 從HG type 0的SCN群體種分離出HG type 1.2.3.5.6.7、HG type 2.5.7及HG type 1.3[21]。另外, 在本研究中, 所有這26份SCN群體均能夠侵染Peking和Pickett, 34.6%的SCN群體能夠侵染寄主 PI90763, 表明需要慎重連續(xù)多年在同一田塊使用抗性基因來自這些抗源的大豆品種, 建議注重同非寄主作物輪作并且重視使用來自其他抗源的抗性品種。

依據(jù)以上鑒定結(jié)果, 每種類型群體各選擇1個(gè)生理小種群體, 利用HG type做進(jìn)一步鑒定表明, 古交市存在1.2.5.6.7 (2號(hào)小種)、1.2.3.5.6.7 (4號(hào)和潛在優(yōu)先發(fā)展為 X12的小種)及 1.2.3.4.5.6.7 (X12小種), 見表 2。本研究結(jié)果也反映了現(xiàn)有的 HG tpye不能區(qū)分開4號(hào)小種和潛在優(yōu)先發(fā)展為X12小種群體。依據(jù)現(xiàn)有SCN群體, 尤其是X12小種的出現(xiàn), 需要形成新的大豆胞囊線蟲生理小種鑒定模式。

3 討論

3.1 大豆胞囊線蟲生理小種鑒別模式選擇

目前對(duì)大豆胞囊線蟲生理小種類型鑒別, 是利用不同鑒別寄主以區(qū)分致病力不同的線蟲群體, 常用的方法有 2個(gè), 分別為 Riggs和 Schmitt[5]采用 4個(gè)鑒別寄主建立的16個(gè)小種模式(Race模式), Niblack等[6]采用 7個(gè)鑒別寄主建立的 128個(gè)小種模式(HG type模式)。后一種方法將小種劃分得更細(xì)?；?2種劃分方法適宜的使用范疇, 本研究是從抗病育種目標(biāo)出發(fā), 同 2012—2015年調(diào)查時(shí)一樣, 仍認(rèn)為小種不宜劃分過細(xì), 據(jù)已有研究結(jié)果表明, 線蟲分布較為復(fù)雜, 劃分過細(xì)容易給抗病品種選育及采取防御措施帶來困惑。同時(shí), 為了便于同國內(nèi)已有研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析, 本研究仍然選擇使用Riggs鑒別模式對(duì)大豆胞囊線蟲新小種 X12分布進(jìn)行研究。為了進(jìn)一步從4號(hào)小種中鑒定出X12小種,在鑒別模式中, 本研究增加了國內(nèi)優(yōu)異抗源興縣灰皮支。

表2 利用HG type模式鑒定采集自古交市不同生理小種類型的樣本(2019-2020年)Table 2 Samples of different physiological subtypes collected from GuJiao city with HG type in 2019 and 2020

3.2 大豆胞囊線蟲新小種 X12分布及最初發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)周圍的生理小種分布概況

本研究是在前期調(diào)查研究的基礎(chǔ)上, 對(duì)大豆胞囊線蟲X12首次發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)——古交市邢家社周圍生理小種分布做進(jìn)一步調(diào)查研究。在調(diào)查中, 途經(jīng)每一個(gè)村莊的大豆或其他豆科作物田塊, 均能在植物根系上看到胞囊, 表明古交市田間受大豆胞囊線蟲侵染嚴(yán)重, 這與2012—2015年調(diào)查顯示山西省感染SCN嚴(yán)重的結(jié)果相符。此次共采集病土33份, 其中26份鑒定出生理小種類型。由于X12是我們首次發(fā)現(xiàn)的具有超強(qiáng)致病力新小種, 因此, 為了進(jìn)一步了解 X12小種的分布, 本次調(diào)查以邢家社為中心, 開展了更為密集的取樣, 研究結(jié)果比較系統(tǒng)地反映了X12首次發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)周圍生理小種分布的概況, 每份土樣附有精確的經(jīng)緯度記錄, 這為今后進(jìn)行周期監(jiān)控研究奠定了基礎(chǔ)。從本次調(diào)查結(jié)果來看, 古交市大豆胞囊線蟲發(fā)生普遍, 2號(hào)和 4號(hào)小種分別占57.7%和 42.3%, 除 2份 4號(hào)小種被進(jìn)一步鑒定為X12外, 未檢測(cè)到其他類型的生理小種。在邢家社采集的樣本本次鑒定結(jié)果仍是 X12, 在生理小種分布圖中標(biāo)為 1; 另一個(gè)鑒定為 X12的是在古交市河口鎮(zhèn)采集的樣本, 在生理小種分布圖中標(biāo)記為2 (圖1); 另外有3個(gè)樣本, 其線蟲群體可以在興縣灰皮支上寄生, 但尚未使興縣灰皮支達(dá)到感病水平, 這 3個(gè)樣本的采集地點(diǎn)在生理小種分布圖中分別標(biāo)記為5、21、27, 推測(cè)這3個(gè)采集地點(diǎn)SCN群體有可能會(huì)優(yōu)先發(fā)展為 X12小種。以上研究結(jié)果表明, 在不同地點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了 X12群體; 在X12周圍僅存在2號(hào)、4號(hào)小種; 發(fā)現(xiàn) 3份能在興縣灰皮支上寄生的 4號(hào)SCN群體, 但是尚未達(dá)到感病水平。

在這 26份鑒定出生理小種類型的樣本中, 其SCN群體均能在Peking、Pickett和PI88788上成功寄生。而且在Peking和 PI88788寄生的FI大于50的SCN群體分別占73.1%和57.7%, Peking和PI88788是目前被美國廣泛利用的抗源[22]。另外, 在PI88788上的FI高的樣本并不局限于土壤中胞囊蟲卵濃度大的樣本, 在11份通過擴(kuò)繁胞囊并接種鑒定出生理小種類型的樣本中, 其SCN群體在PI88788上的FI范圍為 26～85。據(jù)分析, 田間 SCN群體在 PI88788和Peking上寄生指數(shù)的增高, 是由于抗性來自PI88788的有限抗性品種的重復(fù)利用[12,23-24]。但就我們所知,目前利用 PI88788抗源培育的抗病品種尚未在山西推廣應(yīng)用。

3.3 在山西省出現(xiàn)超強(qiáng)致病力大豆胞囊線蟲新小種X12的原因分析

多年來, 山西省一直是感染大豆胞囊線蟲最嚴(yán)重的省份, 所以, 目前國內(nèi)很多優(yōu)異抗源也來自山西省。但是致病性較強(qiáng)的4號(hào)小種集中分布在山西省[4]以及 X12小種在古交市被發(fā)現(xiàn)的原因, 尚不明晰。本研究做如下推測(cè): 首先, 土質(zhì)適宜。2012—2015年調(diào)查研究結(jié)果表明, 能鑒定出生理小種的土樣集中分布在山西省、河北省和河南黃河沿岸, 這些屬于沙性土壤的地區(qū), 推測(cè)是沙性土質(zhì)適宜大豆胞囊線蟲滋生。其次, 氣候適宜。山西省的氣候適宜線蟲繁殖, 古交市屬于山區(qū), 常年在 7月份均溫 23℃, 平均年降水量 428.60 mm, 這正是胞囊繁殖的季節(jié)。因而線蟲群體通過內(nèi)部多代雜交,從而提高了其致病能力。第三, 在山西省, 目前尚缺乏抗病品種的推廣應(yīng)用, 是生理小種致病性增強(qiáng)的另一個(gè)原因。

3.4 古交市大豆胞囊線蟲生理小種分布特點(diǎn)及其對(duì)育種工作的啟示

本研究結(jié)果表明, 在古交市僅檢測(cè)到了2號(hào)、4號(hào)和 X12生理小種, 再次表明大豆胞囊線蟲分布有一定的區(qū)域性[4,10]。鑒于X12小種的超強(qiáng)致病能力,目前又沒有相應(yīng)的抗源, 暫時(shí)限制了針對(duì) X12小種大豆抗病品種培育工作的開展。為緩解由X12小種擴(kuò)散帶來的經(jīng)濟(jì)損失, 建議從以下 4個(gè)方面開展防御工作: (1)培育多抗品種。鑒于生理小種的交叉分布特點(diǎn), 培育兼抗 2個(gè)或 2個(gè)以上生理小種的大豆品種, 在古交市推廣應(yīng)用; (2)加速抗源篩選。可通過擴(kuò)大抗源篩選范圍, 比如從大豆資源之外的其他豆科作物、野生豆中進(jìn)行抗源篩選, 克隆抗病基因, 為培育抵御X12小種的大豆抗病品種提供資源; (3)依據(jù)當(dāng)?shù)卣α? 引導(dǎo)農(nóng)戶采取與非豆科作物輪作,適當(dāng)采用化學(xué)劑殺蟲對(duì)線蟲進(jìn)行毒殺, 即便付出更高的經(jīng)濟(jì)代價(jià), 也要對(duì)已經(jīng)發(fā)展為 X12或會(huì)優(yōu)先發(fā)展為X12的群體的田塊進(jìn)行防治, 以限制X12群體致病性的進(jìn)一步升級(jí)和擴(kuò)散; (4)定期調(diào)查古交市SCN生理小種分布。

4 結(jié)論

古交市大豆胞囊線蟲分布廣泛、田間受害嚴(yán)重。經(jīng)調(diào)查所有田塊均有大豆胞囊線蟲分布; 本次調(diào)查研究發(fā)現(xiàn), 在 X12首次發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)邢家社周圍集中分布有 2號(hào)和 4號(hào)小種, 此次調(diào)查在河口鎮(zhèn)也發(fā)現(xiàn)了X12小種群體, 且有3個(gè)地點(diǎn)的SCN群體有可能會(huì)優(yōu)先發(fā)展為 X12小種; 當(dāng)前應(yīng)采取強(qiáng)有力的輪作措施或使用化學(xué)殺蟲劑方案, 限制X12小種的擴(kuò)散。