戴麗雪，汪俊

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(肥大細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，臨床上反復(fù)發(fā)作喘息、氣急、胸悶和咳嗽，包括了氣道高反應(yīng)性、氣道慢性炎癥、黏液分泌和氣道重構(gòu)等機(jī)制[1]。近年來(lái)，全球哮喘的發(fā)病率呈不斷升高，2014年底哮喘患者已達(dá)3.34億[2]，而預(yù)計(jì)在2025年將達(dá)到4億左右[3]。程序性死亡受體1(PD-1)是屬于CD28/CTLA4家族的免疫受體，與配體PD-L1或PD-L2協(xié)同負(fù)調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，而阻斷PD-1/PD-Ls信號(hào)通路能激活宿主免疫系統(tǒng)。本文就PD-1及其配體信號(hào)通路在哮喘機(jī)制中的作用作一綜述。

Th1/Th2失衡被認(rèn)為是哮喘發(fā)生的經(jīng)典途徑[4]，但研究發(fā)現(xiàn)，往往哮喘患者中只有1/3的人是通過(guò)經(jīng)典途徑介導(dǎo)哮喘的發(fā)展，Th1/Th2失衡機(jī)制不足以完全解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制，其他CD4+T細(xì)胞亞群可能在哮喘中扮演一定的角色。T細(xì)胞識(shí)別抗原提呈細(xì)胞(APC)后可介導(dǎo)免疫反應(yīng)，也可以促進(jìn)過(guò)敏性疾病的發(fā)展。而T細(xì)胞的激活需要兩個(gè)信號(hào)，第一個(gè)是信號(hào)免疫應(yīng)答特異性，TCR識(shí)別抗原提呈細(xì)胞上的主要組織相容性II類(lèi)肽復(fù)合物；第二個(gè)是不可或缺的非特異性共刺激信號(hào)(激活或者抑制)，共信號(hào)受體通常在免疫突觸處與TCR分子共定位，與TCR信號(hào)協(xié)同促進(jìn)或抑制T細(xì)胞活化和功能。共刺激分子[5]能夠精細(xì)的調(diào)控炎癥疾病發(fā)生發(fā)展，主要分為兩大類(lèi)(表1)：B7:CD28家族的分子，如程序性死亡配體(PD-Ls)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、CD80和CD86；腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的分子，如OX40、CD27、CD30和CD40。程序性死亡受體(PD-1)及其配體(PD-Ls)屬于B7/CD28家族，在T細(xì)胞活化和耐受中具有廣泛的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)作用，生理狀態(tài)下PD-1/PD-Ls信號(hào)通路能保護(hù)機(jī)體自身組織免受攻擊[6]。因此，了解PD-1/PD-Ls信號(hào)通路與哮喘之間的相關(guān)機(jī)制有利于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)治療過(guò)敏性疾病的潛在靶點(diǎn)。

表1 共刺激分子在過(guò)敏性疾病和哮喘中的作用Table 1 Role of costimulatory molecules in allergic disease and asthma

1 PD-1/PD-Ls的結(jié)構(gòu)和表達(dá)

程序性細(xì)胞死亡受體-1被稱(chēng)為剎車(chē)分子，具有一個(gè)IgV結(jié)構(gòu)域的殘基，是免疫球蛋白超家族的一員，常表達(dá)于T細(xì)胞表面，并且能誘導(dǎo)T細(xì)胞、B細(xì)胞以及單核細(xì)胞的激活，在外周耐受中起著抑制作用從而避免機(jī)體處于過(guò)度活躍的狀態(tài)。缺乏PD-1受體的小鼠最終能發(fā)展成自身免疫性疾病，導(dǎo)致外周耐受的喪失[7]。PD-1有兩個(gè)配體PD-L1(也稱(chēng)為B7-H1或CD274)和PD-L2(也稱(chēng)為B7-DC和CD273)，屬于B7:CD28受體家族，PD-L1和PD-L2二者在氨基酸同源性上可達(dá)40%，高于B7家族的其他配體[8]?？梢园l(fā)現(xiàn)PD-L1和PD-L2都能在肥大細(xì)胞上表達(dá)，但靜息狀態(tài)下T細(xì)胞和B細(xì)胞均不表達(dá)PD-1。而相較于PD-L2，PD-L1表達(dá)范圍明顯更寬，PD-L1不但能表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、培養(yǎng)的骨髓源性肥大細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞以及多種非造血細(xì)胞上表達(dá)[9-10]，Dong等[11]報(bào)告PD-L1高表達(dá)于大多數(shù)癌組織中，癌細(xì)胞可以通過(guò)其表面的PD-L1與T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合來(lái)逃脫免疫系統(tǒng)的追殺，起到損害抗腫瘤的T細(xì)胞反應(yīng)，這就為通過(guò)阻斷PD-1治療腫瘤提供了一條新道路[12]。PD-L2只在樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓來(lái)源的肥大細(xì)胞上誘導(dǎo)表達(dá)，但PD-L2的親和力卻是PD-L1的2～6倍。

2 PD-1/PD-Ls信號(hào)通路在哮喘中的作用機(jī)制

2.1 PD-1/PD-Ls信號(hào)通路的生物學(xué)功能

利用單克隆抗體的Fab片段來(lái)研究PD-1和PD-L1/PD-L2相互作用及主要差異，發(fā)現(xiàn)PD-L1的配體不僅為PD-1，還存在的另一個(gè)配體CD28,能促進(jìn)T細(xì)胞活化和存活[13]。PD-L1、PD-L2不僅可以誘導(dǎo)不同的功能，而且二者之間存在競(jìng)爭(zhēng)交叉，在結(jié)合和解離特征水平上存在顯著差異，PD-L1發(fā)生的構(gòu)象變化使與PD-1的結(jié)合機(jī)制更復(fù)雜[14]。PD-1/PD-Ls信號(hào)通路(圖1、2)通過(guò)抑制PI3K/Akt和Ras/MEK/Erk途徑，抑制SKP2的轉(zhuǎn)錄和激活Smad3來(lái)靶向細(xì)胞周期機(jī)制。同時(shí)PD-1/PD-Ls信號(hào)通路會(huì)使細(xì)胞周期發(fā)生停滯，使其在細(xì)胞周期的G0/G1期聚集,少部分可能是由于該途徑能夠減少I(mǎi)L-2的生來(lái)阻礙T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的數(shù)量導(dǎo)致的。PD-1/PD-L1信號(hào)通路的刺激信號(hào)使得PD-1胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)與免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)磷酸化，聚集蛋白酪氨酸磷酸SHP-1和SHP-2，繼而抑制AKt上游活化因子PI3K，使得AKt無(wú)法發(fā)生磷酸化且細(xì)胞存活因子Bcl-xl也被抑制，產(chǎn)生負(fù)性刺激，抑制T細(xì)胞活化。

圖 1 PD-1/PD-Ls通路的抑制信號(hào)

圖 2 PD-Ls介導(dǎo)的其他信號(hào)通路

2.2 PD-1/PD-Ls信號(hào)通路通過(guò)iNKT細(xì)胞介導(dǎo)哮喘發(fā)生

在哮喘小鼠中,我們通過(guò)檢測(cè)PD-L1和PD-L2配體，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)過(guò)敏性氣道和iNKT細(xì)胞的作用效應(yīng)，表明了分別缺乏PD-L1和PD-L2配體對(duì)氣道高反應(yīng)性的誘導(dǎo)有截然不同的效應(yīng)[15]。PD-L2與PD-1的結(jié)合能使得IL-4、IL-13的降低從而降低氣道高反應(yīng)性[16-17]，而PD-L1與PD-1結(jié)合后的作用恰恰相反會(huì)使AHR升高。缺乏PD-L1或PD-L2配體表達(dá)對(duì)iNKT細(xì)胞的發(fā)育不存在影響，而對(duì)于缺陷iNKT細(xì)胞的小鼠，在致敏原的刺激之下能檢測(cè)到TH2細(xì)胞因子的變化，但最終并沒(méi)有氣道高反應(yīng)性的增高，但從野生型哮喘小鼠轉(zhuǎn)移iNKT細(xì)胞可促進(jìn)AHR的激發(fā)，間接證實(shí)了iNKT細(xì)胞是AHR的必備條件，進(jìn)一步表明了iNKT細(xì)胞在哮喘中的重要作用。

iNKT細(xì)胞激活需要如CD4+T細(xì)胞一樣需要TCR和共刺激分子的共同刺激信號(hào)，PD-L2能與iNKT細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合并激活。過(guò)敏源(OVA)致敏小鼠時(shí)，缺乏PD-L2配體的小鼠AHR和氣道炎癥的嚴(yán)重程度都明顯高于野生型小鼠，并且相應(yīng)的iNKT細(xì)胞產(chǎn)生的Th2細(xì)胞因子(如IL-4)也多于野生組?？筆D-L2單抗作用小鼠肺中嗜酸性粒細(xì)升高以及Th2細(xì)胞因子生成，能增強(qiáng)哮喘反應(yīng)，猜測(cè)是因?yàn)樽钄嗔薖D-L2對(duì)IL-5和IL-13產(chǎn)生的負(fù)信號(hào)[18]。由PD-L2介導(dǎo)的IL-4反饋環(huán)能抑制其自身的持續(xù)增加從而控制哮喘的嚴(yán)重程度，而缺乏PD-L1配體的小鼠iNKT細(xì)胞分泌的IFN-γ水平相較于野生型小鼠的iNKT細(xì)胞分泌的IFN-γ水平顯著提PD-1/PD-L1信號(hào)通路的刺激信號(hào)使得PD-1胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)與免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)磷酸化，聚集蛋白酪氨酸磷酸SHP-1和SHP-2，繼而抑制AKt上游活化因子PI3K，使得AKt無(wú)法發(fā)生磷酸化且細(xì)胞存活因子Bcl-xl也被抑制，抑制細(xì)胞活化，從而降低下游分子的激活；PD-1：程序性死亡受體1；PD-Ls：程序性死亡配體；ITIM：免疫受體酪氨酸抑制序列；ITSM：免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序；ERK：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；PKC：蛋白激酶C；NFAT：活化T細(xì)胞核因子；PLCy1：磷脂酶Cy1；PLCy2：磷脂酶Cy2；SYK：脾酪氨酸激酶；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶；AKT：絲氨酸/蘇氨酸激酶(蛋白激酶B)；SHP-1：蛋白酪氨酸磷酸酶1；SHP-2：蛋白酪氨酸磷酸酶2；BCR：B細(xì)胞表面受體；TCR：T細(xì)胞表面受體；MHC：主要組織相容性復(fù)合體；APC：抗原呈遞細(xì)胞；CD3：白細(xì)胞分化抗原3；CD28：白細(xì)胞分化抗原28；Zap70：70 kDa的酪氨酸激酶；IL-2：白細(xì)胞介素-2高，氣道高反應(yīng)性降低，但抗PD-1單抗治療哮喘反應(yīng)卻沒(méi)有明顯反應(yīng)效果[19]。因此，了解調(diào)節(jié)PD-L2/PD-L1和iNKT細(xì)胞之間的復(fù)雜機(jī)制有利于制定哮喘治療的新方案，靶向iNKT細(xì)胞的治療可能在臨床上有效的限制氣道高反應(yīng)性和哮喘的發(fā)展。

2.3 PD-1/PD-L1信號(hào)通路通過(guò)Treg/Th17平衡介導(dǎo)哮喘發(fā)生

PD-1及其配體能在調(diào)節(jié)T細(xì)胞上面表達(dá)，而PD-L1在調(diào)節(jié)誘導(dǎo)的iTreg細(xì)胞發(fā)育和維持功能方面具有關(guān)鍵作用，在缺乏PD-L1配體小鼠中，功能性Foxp3+iTreg細(xì)胞的發(fā)育存在缺陷。Treg細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制能力，叉頭翅轉(zhuǎn)錄因子盒3蛋白(Foxp3)是Tregs的最佳標(biāo)記物[20]。目前可將其分為兩類(lèi)，一類(lèi)是來(lái)源胸腺并且能夠高度表達(dá)叉頭狀/螺旋狀轉(zhuǎn)錄因子P3(Foxp3)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，另一類(lèi)是由變應(yīng)原誘導(dǎo)產(chǎn)生的誘PD-L1可以通過(guò)連接B7-1介導(dǎo)抑制信號(hào)，單獨(dú)PD-L1可以誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Foxp3+誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞積極抑制效應(yīng)T細(xì)胞;PD-L1和PD-L2同樣可以通過(guò)非PD-1受體提供刺激陽(yáng)性信號(hào); PD-L1：程序性死亡配體-1；PD-L2：程序性死亡配體-2；B7-1(CD28)：白細(xì)胞分化抗原80；MHC：主要組織相容性復(fù)合體；APC：抗原呈遞細(xì)胞；TCR：T細(xì)胞表面受體；Foxp3+iTreg cells：為表達(dá)叉頭狀家族轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的調(diào)節(jié)T細(xì)胞導(dǎo)性Treg細(xì)胞，能分泌IL-10、TGF-β等發(fā)揮抑炎作用，此外也能直接刺激或改變T細(xì)胞表型和功能引起Th1細(xì)胞反應(yīng)。

Treg/Th17在調(diào)節(jié)哮喘經(jīng)典途徑TH1/TH2比例失衡中具有內(nèi)在平衡能力，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)和變態(tài)反應(yīng)中方面發(fā)揮的重要作用[21]。PD-1在PD-L1中的部分作用可能是通過(guò)Treg/Th17免疫發(fā)揮功能來(lái)實(shí)現(xiàn)平衡的免疫應(yīng)答。PD-L1一方面能夠通過(guò)降低Akt及其下游底物mTOR信號(hào)、減弱p42/ERK2的磷酸化來(lái)誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞的發(fā)生，而另一方面通過(guò)增強(qiáng)Foxp3的表達(dá)來(lái)促進(jìn)iTreg細(xì)胞的誘導(dǎo)和維持來(lái)抑制T細(xì)胞的反應(yīng)，保護(hù)組織免受損傷。阻斷PD-L1導(dǎo)致Treg細(xì)胞數(shù)量不足，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞凋亡和降低Treg/Th17比率破壞機(jī)體免疫耐受[22]。繼來(lái)自肺或脾組織的NTregs和iTregs受體小鼠經(jīng)歷了AHR和過(guò)敏性氣道炎癥的逆轉(zhuǎn)，治療效果從第4周明顯表現(xiàn)。我們研究了PD-1在Tregs治療中的作用，分離綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織當(dāng)中的Treg細(xì)胞，可觀察到小鼠氣道炎癥以及氣道高反應(yīng)性的增加，當(dāng)抗PD-1基因敲除分離過(guò)后的Treg在體外對(duì)T細(xì)胞的抑制減弱，而使用雌激素治療可發(fā)現(xiàn)功能恢復(fù)，猜測(cè)Tregs通過(guò)PD-1受體起到抑制部分效應(yīng)T細(xì)胞的作用，抗PD-1抗體能阻斷Treg的治療作用[23]。

我們應(yīng)該了解PD-1受體對(duì)Tregs調(diào)節(jié)過(guò)敏性哮喘的AHR和氣道炎癥至關(guān)重要，PD-L1可調(diào)控Treg細(xì)胞從而作為哮喘的有利治療靶點(diǎn)，通過(guò)提高PD-1及其配體PD-L1/PD-L2的表達(dá)和活性,為治療過(guò)敏性哮喘開(kāi)辟新的里程碑。

2.4 PD-L2獨(dú)立于PD-1/PD-L1信號(hào)通路介導(dǎo)哮喘發(fā)生

PD-L1雖然在DC上高表達(dá)，但暫時(shí)還未發(fā)現(xiàn)PD-L1對(duì)DC的內(nèi)在作用，但對(duì)于同一細(xì)胞上同時(shí)存在PD-L1和PD-L2，可能由于二者之間存在競(jìng)爭(zhēng)作用而無(wú)法觀察到PD-L2的效應(yīng)[24]。在哮喘小鼠模型中，致敏小鼠肺DCs和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)PD-L2，當(dāng)哮喘小鼠注射PD-L2抗體，而不是PD-1抗體或PD-L1抗體，可增強(qiáng)氣道高反應(yīng)性和促進(jìn)TH2細(xì)胞因子(IL-4、IL-13等)的產(chǎn)生，Matsumoto等[25]也通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較缺乏PD-L2小鼠及其野生型對(duì)照組之間的哮喘表型，探討了PD-L2誘導(dǎo)的下游途徑。當(dāng)小鼠被致敏時(shí)，其肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組。PD-L2缺乏小鼠的AHR以及BALF中的IL-5和IL-13的濃度明顯高于對(duì)照組，而IFN-Y的濃度明顯低于對(duì)照組。PD-L2相較于PD-L1阻斷具有更大的效應(yīng)導(dǎo)致T細(xì)胞的大部分增強(qiáng)，間接說(shuō)明了PD-L2對(duì)于抑制T細(xì)胞增殖的起主導(dǎo)重要地位[26]。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)了PD-L2對(duì)自身的DCs存在內(nèi)在的作用，區(qū)別于PD-1/PD-L2信號(hào)通路產(chǎn)生的效果，它能介導(dǎo)IL-12細(xì)胞因子增多和T細(xì)胞的激活來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答[27]，PD-L2在哮喘中的作用存在相互矛盾的現(xiàn)象。

哮喘的嚴(yán)重程度與PD-L2的表達(dá)程度相關(guān)，在中重度哮喘小鼠中尤其明顯。過(guò)敏源致敏小鼠后，在效應(yīng)期中單純阻斷PD-L2降低了小鼠氣道的高反應(yīng)性,但其IgE、EOS數(shù)量卻未見(jiàn)明顯變化，而當(dāng)阻斷PD-1時(shí)AHR卻無(wú)明顯變化，這個(gè)過(guò)程與IL-12的降低有關(guān)[28]，變應(yīng)原致敏APC與PD-L2抑制IL-12的產(chǎn)生，而IL-12能抵抗IL-13的基因誘導(dǎo)和激活因子STAT6的磷酸化從而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，在效應(yīng)期阻斷IL-12，PD-L2直接促進(jìn)IL-13促進(jìn)過(guò)敏性哮喘高反應(yīng)性，從側(cè)面也表明了IL-12的生成并不是借由TH2細(xì)胞反應(yīng)的相對(duì)減弱造成的，而是IL-12與IL-13之間的存在重要聯(lián)系。由于對(duì)于分別阻斷PD-L2和PD-1可觀察到AHR的不同結(jié)果以及PD-L2能在抑制PD-L2與PD-1相互作用之下還能抑制的IL-12的產(chǎn)生，我們從中可以得知PD-L2可能以獨(dú)立于PD-1作用于其他配體的方式促進(jìn)AHR，從而調(diào)節(jié)哮喘的嚴(yán)重程度，靶向PD-L2對(duì)哮喘具有潛在治療作用。

2.5 PD-L2通過(guò)Th9細(xì)胞(不同的T細(xì)胞亞群)介導(dǎo)哮喘發(fā)生

PD-L2可以通過(guò)不同的T細(xì)胞亞群來(lái)影響哮喘的發(fā)生機(jī)制。TH9是CD4+T細(xì)胞的不同亞群之一，體外研究表明，Tn9亞群的極化需要TGF-β和IL-4的存在以及IFN-γ的缺失。PD-L2能通過(guò)IFN-γ依賴性機(jī)制調(diào)節(jié)哮喘。慢性過(guò)敏源暴露后,Kerzerho等[29]研究中發(fā)現(xiàn)致敏小鼠4周前肺的Th2細(xì)胞因子分泌，而在第6周之后可見(jiàn)TH9 因子的大量堆積，肺中由于缺乏TGF-β、IL-1a存在Th9細(xì)胞發(fā)生。試驗(yàn)中借用缺陷的PD-L2小鼠來(lái)觀察其對(duì)Th9的作用效應(yīng)以及AHR的調(diào)控情況，數(shù)據(jù)顯示PD-L2缺陷小鼠肺組織TGF-β的顯著提升，促進(jìn)Th9細(xì)胞因子增強(qiáng)發(fā)展和粘液分泌，導(dǎo)致肺部炎癥過(guò)程嚴(yán)重。PD-L2缺陷小鼠的肺組織IL-9濃度和疾病嚴(yán)重程度具有一定的相關(guān)性，用抗IL-9抗體能過(guò)減輕AHR和肺部炎癥[30]。PD-L2在對(duì)慢性哮喘患者中Th9細(xì)胞因子、氣道高反應(yīng)性調(diào)節(jié)中起著重要效果，深入研究PD-L2、Th9細(xì)胞之間的認(rèn)識(shí)能為過(guò)敏性哮喘以及自身免疫性疾病提供了新的策略，但在急性重癥哮喘中的作用還未明確闡述。

3 討論

哮喘是一種異質(zhì)性疾病，受到眾多因素調(diào)控但具體發(fā)病機(jī)制還未明確。哮喘嚴(yán)重影響患者的生活水平，增加社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)，已成為現(xiàn)今社會(huì)中日益突出的健康問(wèn)題。免疫療法即靶向藥物治療已成為精準(zhǔn)醫(yī)療的主要潮流[31]，共刺激分子在過(guò)敏性疾病和哮喘中起到不可或缺的作用，PD-1/PD-Ls信號(hào)通路相互作用機(jī)制復(fù)雜，B7-2在一定程度上也促進(jìn)了哮喘的發(fā)生，B7-H3也能通過(guò)調(diào)節(jié)不同T細(xì)胞亞群活性促進(jìn)自身免疫性疾病[32]，研究人員也發(fā)現(xiàn)先天性淋巴樣細(xì)胞(ILC)在過(guò)敏源刺激下能高水平表達(dá)PD-1，引起肺部炎癥，它們之間對(duì)哮喘的影響程度不一[33]。目前研究最多熱議的就是PD-1/PD-Ls信號(hào)通路。PD-1刺激一方面有助于移植耐受、維持自身免疫平衡以及減少自身免疫性疾病的發(fā)生[34]，但另一方面也同時(shí)參與慢性病毒感染和癌癥的免疫逃逸機(jī)制[35]，目前PD-1/PD-L1抑制劑(例如納武利尤單抗，帕博利珠單抗等)常用于癌癥疾病的治療，藥物不良反應(yīng)也是常常存在的，在過(guò)敏性疾病上的應(yīng)用研究還較少。不過(guò)相信通過(guò)深入研究闡述它們之間的發(fā)病機(jī)制，提高PD-1及其配體PD-Ls的表達(dá)和活性,可以為精準(zhǔn)治療過(guò)敏性哮喘開(kāi)辟新紀(jì)元，但如何在免疫性疾病和腫瘤治療之間達(dá)到最佳平衡還是需要進(jìn)行探索思考。