楊燕霞，王 欣，魏素珍，馬 斌，柳小平

(西北民族大學(xué) 甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030)

0 引言

過敏性哮喘是一種呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病，主要表現(xiàn)為咳嗽、喘息和可逆性氣道阻塞[1].過敏性哮喘發(fā)病率高且治療困難，給病人造成較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān).傳統(tǒng)認(rèn)為，氣道高反應(yīng)性(AHR)、肺部炎癥、嗜酸性粒細(xì)胞增多和黏液增生是過敏性哮喘的標(biāo)志[2].在過敏性哮喘發(fā)病過程中，嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞均參與了氣道免疫炎性反應(yīng)，并與患者的癥狀密切相關(guān)[3].然而關(guān)于這些免疫細(xì)胞參與過敏性哮喘發(fā)病過程的分子機(jī)制目前尚不清楚.隨著基因組在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用，生物信息學(xué)已經(jīng)成為揭示疾病分子機(jī)制的一種重要工具.郭黎彥等[4]應(yīng)用加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)探究了支氣管哮喘中的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路.Shan等[5]應(yīng)用生物信息學(xué)鑒定了維生素D受體在支氣管哮喘中的作用.目前還沒有系統(tǒng)評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況的研究.CIBERSORT[6]是一種基于基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況的新方法.R語(yǔ)言即可以進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，又可以進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化，已經(jīng)成為生物信息學(xué)必不可少的分析工具.在該研究中，我們既分析了過敏性哮喘發(fā)病過程中關(guān)鍵的基因和信號(hào)通路，又應(yīng)用CIBERSORT對(duì)支氣管哮喘患者免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行分析，以便從免疫細(xì)胞浸潤(rùn)方面闡述支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制.研究結(jié)果既為過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制研究提供參考，又有助于開發(fā)過敏性哮喘新的治療方法.

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

GEO(Gene Expression Omnibus,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[7]是一個(gè)公共的基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，收集了大量疾病的功能基因組數(shù)據(jù)集.我們使用R語(yǔ)言GEOquery包[8]從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載了支氣管哮喘基因數(shù)據(jù)集GSE63142中的表達(dá)譜數(shù)據(jù).數(shù)據(jù)集GSE63142中的樣本均來源于人.此平臺(tái)基于GPL6480 Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F(Probe Name version).數(shù)據(jù)集GSE63142中共有155例支氣管上皮的樣本，其中包括哮喘病人樣本128例和正常人樣本27例.

1.2 原始表達(dá)譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

我們使用R語(yǔ)言中affy包對(duì)GSE63142中的原始基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校檢、歸一化處理，并使用密度圖和二維PCA聚類圖展示原始數(shù)據(jù)預(yù)處理前后的結(jié)果.使用R語(yǔ)言中的limma包對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行差異表達(dá)分析，從而得到差異表達(dá)基因.

1.3 免疫基因的GO分析、KEGG通路分析與GSEA分析

基因本體論(gene ontology,GO)可對(duì)基因參與的生物過程進(jìn)行注釋.京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)是一個(gè)手工繪制的信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)，可對(duì)參與疾病發(fā)病機(jī)制中重要的信號(hào)通路進(jìn)行注釋.基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)是用來評(píng)估一個(gè)預(yù)先定義的基因集中的基因在與表型相關(guān)度排序的基因表中的分布趨勢(shì)，從而判斷其對(duì)疾病的作用.使用R語(yǔ)言clusterProfiler包進(jìn)行GO分析、KEGG通路富集和GSEA分析，發(fā)現(xiàn)顯著性基因富集的臨界值為P<0.05.

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因的篩選

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)(http://string-db.org;version:11.0)是用于注釋蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的在線工具，分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，可以對(duì)疾病中復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行注釋.Cytoscape軟件可對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，其插件cytoHubba可用于識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)中的Hub節(jié)點(diǎn).將所有的免疫基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析并通過Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，再通過插件cytoHubba識(shí)別Hub基因.利用GOSemSim包和clusterProfiler包計(jì)算Hub基因分子功能和細(xì)胞組分的相似性，從而分析得到Hub基因的相似程度.

1.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的可視化及評(píng)價(jià)

CIBERSORT(https://cibersort.stanford.edu/)是基于線性支持向量回歸的原理對(duì)免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積的一個(gè)網(wǎng)頁(yè)工具，可用來估計(jì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況.將GSE63142中的基因表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)上傳到CIBERSORT，過濾輸出P<0.05的樣本，得到免疫細(xì)胞的表達(dá)矩陣.為了評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞在過敏性哮喘中的浸潤(rùn)情況，我們監(jiān)測(cè)了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性和免疫細(xì)胞相互作用的網(wǎng)絡(luò).R語(yǔ)言ggplot2包繪制小提琴圖展示了22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異；R語(yǔ)言corrplot包繪制相關(guān)熱圖以展示22種免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性；R語(yǔ)言igraph包繪制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖以展示22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的互作情況，以P<0.05、|相關(guān)系數(shù)|>0.15為互作標(biāo)準(zhǔn).

1.6 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)分析

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是系統(tǒng)分析各種疾病類型免疫滲透的數(shù)據(jù)庫(kù)，利用這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可統(tǒng)計(jì)6種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)與基因的相關(guān)性.使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證，再用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)免疫細(xì)胞與過敏性哮喘中Hub基因進(jìn)行相關(guān)性分析.

2 結(jié)果

2.1 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理

對(duì)原始基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校檢、歸一化處理，并利用密度圖和二維PCA聚類圖對(duì)原始數(shù)據(jù)預(yù)處理的效果進(jìn)行展示.密度圖結(jié)果表明，原始數(shù)據(jù)均一化效果良好(圖1A、B)；二維PCA聚類圖表明，樣本能夠分開，來源可靠(圖1C、D)，可用于后續(xù)的分析.我們通過差異表達(dá)分析，共得到1 181個(gè)差異表達(dá)免疫基因.

A、B.原始數(shù)據(jù)背景校檢、標(biāo)準(zhǔn)化處理前后基因表達(dá)密度圖；C、D.原始數(shù)據(jù)預(yù)處理前后的PCA聚類圖.

2.2 免疫基因的GO分析、KEGG通路分析與GSEA分析結(jié)果

對(duì)1 181個(gè)差異表達(dá)進(jìn)行GO分析和KEGG分析.GO分析結(jié)果表明(圖2A)：過敏性哮喘發(fā)病主要與谷胱甘肽衍生物生物合成、谷胱甘肽衍生物代謝過程、核苷酸-糖代謝過程、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、花生四烯酸代謝過程、蛋白質(zhì)N-連接糖基化、長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝過程、糖基化、大分子糖基化、蛋白質(zhì)糖基化和細(xì)胞修飾氨基酸代謝等生物過程相關(guān).KEGG分析結(jié)果則表明(圖2B)：花生四烯酸代謝、炎癥介質(zhì)對(duì)TRP通道的調(diào)節(jié)、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路和Fc-epsilon-RI信號(hào)通路等與過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切.對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果表明：IL-17信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、腫瘤壞死因子信號(hào)通路和細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用等通路可能參與了過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制.

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和Hub基因

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化的結(jié)果如圖3A所示.通過cytoHubba插件共得到10個(gè)Hub基因(圖3B)：C3、CX3CL1、NMU、CXCL2、ADORA3、SUCNR1、ACKR3、CXCL3、CXCL6和OPRL1.基于MF和CC來注釋并計(jì)算Hub基因間的相似性，結(jié)果表明(圖3C)：CXCL3、CX3CL1、CXCL6和CXCL2具有結(jié)構(gòu)和功能的相似性，C3、ACKR3和OPRL1具有結(jié)構(gòu)和功能的相似性，ADORA3和SUCNR1具有結(jié)構(gòu)和功能的相似性.

A.GO分析結(jié)果；B.KEGG分析結(jié)果；C.GSEA分析結(jié)果.

A.PPI網(wǎng)絡(luò)；B.Hub基因相互作用網(wǎng)絡(luò)；C.Hub基因結(jié)構(gòu)和功能的相似性.

2.4 過敏性哮喘免疫細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)果

22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異結(jié)果顯示(圖4A)：與非哮喘病人比較，過敏性哮喘的病人支氣管中出現(xiàn)明顯的單核細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中心粒細(xì)胞浸潤(rùn).22種免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖(圖4B)結(jié)果則顯示：?jiǎn)魏思?xì)胞與M0巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，而單核細(xì)胞與中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)；M0巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞也呈負(fù)相關(guān)，而與中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)；樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈正相關(guān).22種免疫細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖4C)結(jié)果則顯示，中心粒細(xì)胞與單核細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞具有明顯的相關(guān)性，M0巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞關(guān)系密切，而M0巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞相關(guān)性較弱.

2.5 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)分析

為了進(jìn)一步探究免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，我們利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析了免疫細(xì)胞與10個(gè)Hub基因的相關(guān)性(圖5).結(jié)果表明：樹突狀細(xì)胞與CXCL3、CXCL2突變相關(guān)，M0巨噬細(xì)胞與SUCNR1、OPRL1、ACKR3突變相關(guān)，單核細(xì)胞與OPRL1、CXCL3、CXCL2、C3等基因突變相關(guān)，而與中性粒細(xì)胞相關(guān)的突變基因只有CXCL3.

圖5 Hub基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性熱圖

A.過敏性哮喘中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的豐度；B.免疫浸潤(rùn)相關(guān)性熱圖；C.免疫細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò).

3 討論

過敏性哮喘發(fā)病主要是由于自體免疫耐受受損.目前，研究者認(rèn)為[8-11]，外界刺激導(dǎo)致CD4+Th2細(xì)胞分泌IL-4，IL-5，IL-9、IL-13、IL-25和IL-17等亞類細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可通過刺激B細(xì)胞生長(zhǎng)、啟動(dòng)免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換為IgE、肥大細(xì)胞的分化、嗜酸性粒細(xì)胞增多、細(xì)胞吞噬作用和纖維化等，從而使病人產(chǎn)生癥狀.除此之外，氣道中的黏膜免疫細(xì)胞，如先天淋巴樣細(xì)胞(ILC，巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞)和適應(yīng)性免疫細(xì)胞(如BandT淋巴細(xì)胞)在過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用[12-13].目前，雖然研究者對(duì)過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但關(guān)于過敏性哮喘的分子免疫機(jī)制仍然不清楚.因此，利用生物信息學(xué)的分析方法，可對(duì)過敏性哮喘后的關(guān)鍵免疫基因和信號(hào)通路進(jìn)行篩選，又能對(duì)免疫細(xì)胞的作用模式進(jìn)行分析.

為了注釋過敏性哮喘發(fā)病過程中基因的功能，我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，也對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行GSEA分析.通過KEGG分析富集到了炎癥介質(zhì)對(duì)TRP通道的調(diào)節(jié)、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路和Fc-epsilon-RI等信號(hào)通路.GSEA分析主要富集到IL-17信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、腫瘤壞死因子信號(hào)途徑和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等信號(hào)通路.TRP通道是一種瞬態(tài)受體電位離子通道，抑制TRP通道可緩解支氣管哮喘患者的咳嗽癥狀，是氣道疾病癥狀緩解藥物的新興分子靶標(biāo)候選物[14].Fc-epsilon-RI受體是IgE高親和力受體，過敏性哮喘發(fā)病過程中產(chǎn)生的嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)高親和力的Fc-epsilon-RI受體.IgE與該受體結(jié)合在過敏性哮喘的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[15-16].Th1和Th2細(xì)胞分化在過敏性哮喘中的作用較為明確，常常作為過敏性哮喘的治療靶細(xì)胞[17-18].氣道中本沒有Th17細(xì)胞，但在過敏性哮喘發(fā)病過程中，Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)移至氣道中以適應(yīng)不良的免疫反應(yīng)，與嚴(yán)重的氣道高反應(yīng)性、黏液產(chǎn)生以及嗜酸性/嗜中性粒細(xì)胞混合炎癥密切相關(guān)[19-20].在我們富集分析的結(jié)果中，只有腫瘤壞死因子信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路在過敏性哮喘中的作用目前尚未報(bào)道.我們的研究有助于發(fā)現(xiàn)過敏性哮喘發(fā)病過程中新的信號(hào)通路.

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，共篩選得到10個(gè)Hub基因:C3、CX3CL1、NMU、CXCL2、ADORA3、SUCNR1、ACKR3、CXCL3、CXCL6和OPRL1.C3是血清中含量最高的補(bǔ)體成分，主要由巨噬細(xì)胞分泌，在補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑中均發(fā)揮重要作用.相關(guān)研究表明[21-23]，C3可通過與C3a受體結(jié)合來調(diào)節(jié)白細(xì)胞激活、平滑肌收縮和血管通透性，但是關(guān)于C3補(bǔ)體引起支氣管哮喘病人癥狀的原理尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究.Wallrapp等研究表明[24]，NMU主要通過激活2型先天性淋巴樣細(xì)胞(ILC2)引起過敏性哮喘中的病理性炎癥反應(yīng).趨化因子家族在過敏性哮喘發(fā)病過程中也發(fā)揮著重要的作用.Goleva等[25]通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8(IL-8)等在過敏性哮喘中的轉(zhuǎn)錄本水平明顯升高.在過敏性哮喘發(fā)病過程中，CXCL2和CXCL6的激活能夠吸引中性粒細(xì)胞聚集到氣道中[26]，而CX3CL1主要通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞遷移和巨噬細(xì)胞分化以及T細(xì)胞依賴性炎癥反應(yīng)在過敏性哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮作用[27-28].目前，關(guān)于SUCNR1、OPRL1、ACKR3和ADORA3在過敏性哮喘中的作用尚不清楚，有待進(jìn)一步的生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

對(duì)22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的豐度進(jìn)行分析，結(jié)果表明：與非哮喘病人相比較，過敏性哮喘的病人支氣管中出現(xiàn)明顯單核細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中心粒細(xì)胞浸潤(rùn).在過敏性哮喘中，單核細(xì)胞替代胚胎肺泡巨噬細(xì)胞而發(fā)揮作用.單核細(xì)胞的TLR信號(hào)能夠促進(jìn)Th2介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞增多和Th1/Th17介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞增多[29-30].樹突狀細(xì)胞(DC)是一種抗原呈遞細(xì)胞.樹突狀細(xì)胞可通過分泌的趨化因子和炎性因子刺激CD4+T細(xì)胞活化，并分化為Th1T細(xì)胞、Th2T細(xì)胞和Th17T細(xì)胞,參與過敏性哮喘中的炎性反應(yīng)[31-33].中性粒細(xì)胞主要通過分泌IL-6、IL-8、IL-13、CM-CSF和TGF-β等炎性因子參與哮喘中的炎性反應(yīng)[34].以上的研究與我們分析的結(jié)果類似，說明我們的分析結(jié)果具有一定的可靠性.而M0巨噬細(xì)胞在過敏性哮喘發(fā)病過程中的作用目前尚未報(bào)道，有待進(jìn)一步的研究.

分析過敏性哮喘發(fā)病過程，在免疫浸潤(rùn)的基礎(chǔ)上揭露了免疫浸潤(rùn)的細(xì)節(jié).單核細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞密切相關(guān).M0巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞具有一定的相關(guān)性，樹突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)相關(guān).Radermecker等[35]研究表明，中性粒細(xì)胞可通過釋放CXCR4增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的抗原提呈作用.Machiels等研究表明[36]，單核細(xì)胞衍生的肺泡巨噬細(xì)胞具有可抑制樹突狀細(xì)胞激活輔助Th2 T細(xì)胞的作用.本研究進(jìn)一步說明，我們的分析真實(shí)可靠，但對(duì)于免疫細(xì)胞間的共同作用仍然有待進(jìn)一步的研究.

Hub基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析的結(jié)果表明，樹突狀細(xì)胞與CXCL3、CXCL2突變相關(guān)，M0巨噬細(xì)胞與SUCNR1、OPRL1、ACKR3突變相關(guān)，單核細(xì)胞與OPRL1、CXCL3、CXCL2、C3等基因突變相關(guān)，中性粒細(xì)胞與CXCL3的突變相關(guān).Mizutani等研究表明[37]，IL-33與IL-17A共同通過CXCL2-CXCR2信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)過敏性哮喘發(fā)病過程中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn).我們的分析結(jié)果詳細(xì)地描述了過敏性哮喘發(fā)病過程中關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性，具有一定的參考價(jià)值.

綜上所述，應(yīng)用生物信息學(xué)的分析方法可得到過敏性哮喘發(fā)病過程中的關(guān)鍵基因、信號(hào)通路和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的情況，既為過敏性哮喘分子機(jī)制的研究提供了一定的參考，也有助于開發(fā)過敏性哮喘的新的靶向藥物.