杜慶鑫，慶 軍，劉攀峰，王 璐，杜蘭英，何 鳳，杜紅巖

(國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心，中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，經(jīng)濟林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，河南 鄭州 450003)

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）為杜仲科（Eucommiaceae）杜仲屬（Eucommia）植物[1]，雌雄異株，是我國特有的名貴藥材和木本油料樹種，廣泛分布于我國亞熱帶到溫帶的28 個?。ㄊ小^(qū)）。杜仲果、葉、皮中均含有豐富的杜仲橡膠，其中，果皮中含量最高。杜仲橡膠有獨特的“橡（塑）二重性”，可開發(fā)出具有熱塑性、熱彈性和橡膠彈性等不同用途的功能材料，廣泛應用于航空航天、國防、電力、醫(yī)療、運動競技等領(lǐng)域，是世界上具有巨大開發(fā)前景的優(yōu)質(zhì)天然橡膠資源[2-3]。杜仲果實不僅橡膠含量高，而且富含油脂。杜仲籽油不飽和脂肪酸含量達90%以上，其中，α-亞麻酸含量高達67.6%，杜仲籽油已被列為新食品原料目錄，是開發(fā)保健品、功能食品、高檔食用油的優(yōu)質(zhì)原料[4-5]。

植物種質(zhì)資源是遺傳改良的基因來源和物質(zhì)基礎，開展種質(zhì)資源遺傳多樣性研究對資源保護和利用具有重要意義。表型性狀變異具有相對穩(wěn)定的遺傳特征，已成為研究遺傳多樣性的重要內(nèi)容，國內(nèi)外已先后對大別山山核桃（Carya dabieshanensis

M.C.Liu et Z.J.Li））[6]、白 櫟（Quercus fabriHance）[7]、柑 橘（Citrus reticulataBlanco）[8-9]、無患子（Sapindus mukorossiGaertn）[10-11]等林木表型性狀變異進行了分析和評價。有關(guān)杜仲種質(zhì)資源遺傳變異和評價已開展了較多研究，杜紅巖等[12]對16 個產(chǎn)地杜仲果實形態(tài)及含膠量差異進行了分析；杜慶鑫等[13]對杜仲種質(zhì)資源雄花形態(tài)性狀變異進行了深入研究；慶軍等[14]發(fā)現(xiàn)，杜仲種質(zhì)資源葉片活性成分表現(xiàn)出豐富的多樣性，并篩選出葉用杜仲優(yōu)良種質(zhì)；于靖[15]分析評價了不同產(chǎn)地、不同基因型杜仲種仁脂肪酸及果皮杜仲膠含量差異。此外，分子標記技術(shù)也廣泛應用于杜仲種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，Wu 等[16]、Yu 等[17]利用ISSR標記對杜仲種質(zhì)資源遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進行了研究，發(fā)現(xiàn)杜仲居群內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，而不同群體間的遺傳多樣性低。利用分子標記技術(shù)可以準確了解植物遺傳多樣性，但最終仍要結(jié)合表型性狀進行分析[18]。目前，對大樣本杜仲種質(zhì)資源果實表型性狀變異研究和綜合評價鮮有報道。本研究對331 份不同來源杜仲種質(zhì)資源果實表型性狀進行多樣性分析，以期揭示杜仲資源表型變異規(guī)律并進行綜合評價，定向篩選優(yōu)良種質(zhì)，為選育適合杜仲產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的優(yōu)良品種提供理論和材料基礎。

1 試驗材料

試驗材料均來自中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心杜仲種質(zhì)資源庫?；驇觳捎? 株小區(qū)，定植株行距為 3 m×3 m。2018 年秋季果實成熟期完成采樣，采后低溫保存至實驗室充分陰干。種質(zhì)來源見表1。

表1 杜仲種質(zhì)資源信息Table 1 Information of Eucommia ulmoides germplasm resources

2 研究方法

2.1 果實形態(tài)性狀測定

四分法隨機抽取果實20 粒，重復3 次。使用電子游標卡尺（精度0.01 mm）分別測量果實和種仁的縱徑、橫徑、側(cè)徑，使用千分之一電子天平測定果實、種仁及包裹種仁果皮百粒質(zhì)量，計算出仁率（出仁率=種仁百粒質(zhì)量/果實百粒質(zhì)量×100%）、果型指數(shù)（果型指數(shù)=果實縱徑/果實橫徑）、果實體積指數(shù)（果實體積指數(shù)=果實縱徑×果實橫徑×果實側(cè)徑）、種型指數(shù)（種型指數(shù)=種仁縱徑/種仁橫徑）、種仁體積指數(shù)（種仁體積指數(shù)=種仁縱徑×種仁橫徑×種仁側(cè)徑）等指標。

2.2 果皮杜仲橡膠含量測定

稱量100 mg 干燥樣品粉末至離心管中，加入1.5 mL 50%無水乙醇，渦旋振蕩1 min，離心2 min，重復3 次；加入1.5 mL 丙酮，渦旋振蕩1 min，離心2 min，重復3 次；加入1.5 mL 丙酮，超聲分離（40 kHz，40℃）40 min，渦旋振蕩1 min，離心2 min，重復2 次；50℃烘箱中烘干；加入1.2 mL 甲苯，渦旋振蕩1 min，超聲提取10 min，離心2 min，收上清液于容量瓶中，加甲苯定容至5 mL，重復提取4 次；采用FTIR 進行檢測，計算1380 cm?1和699 cm?1處的峰面積。

2.3 種仁粗脂肪及脂肪酸含量測定

種仁粗脂肪采用索氏提取原理，質(zhì)量法測定，參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》。種仁粗脂肪中亞麻酸、油酸、亞油酸檢測采用《食品中脂肪酸的測定》（GB 5009.168—2016）。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 整理統(tǒng)計數(shù)據(jù)，運用SPSS 24.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計各性狀的平均值、最大值、最小值和標準差，計算各性狀變異系數(shù)（CV）和遺傳多樣性指數(shù)（H）。根據(jù)平均值（μ）和標準差（σ）將各性狀劃分為10 級，從第1 級Xi<（μ?2σ）到第10 級Xi≥（μ+2σ），每0.5σ為1 級，統(tǒng)計各級的分布頻率。遺傳多樣性指數(shù)計算公式為：H=?∑pilnpi，其中，pi為某一性狀第i級別試驗材料份數(shù)占總份數(shù)的百分比。

聚類分析采用歐式平方距離ward 法。以累積貢獻率 ≥ 85%、特征值 >1 為提取主成分的標準。綜合評價方法為：以各主成分對應的相對貢獻率作為權(quán)重，各主成分得分與相應權(quán)重進行線性加權(quán)求和得到綜合評價函數(shù)[19]，主要公式如下：

式中：Z為杜仲果實綜合評價得分，Zi為各主成分得分值，βi為各主成分對應的相對方差貢獻率，i為主成分數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 果實性狀變異及多樣性分析

331 份杜仲種質(zhì)資源果實性狀變異情況見表2。19 個性狀變異系數(shù)（CV）介于4.64%～25.79%，平均為12.65%，其中，變異系數(shù)較高的為包裹種仁果皮百粒質(zhì)量（25.79%）、種仁百粒質(zhì)量（22.32%）、種仁體積指數(shù)（22.02%）、果實體積指數(shù)（19.53%），變異系數(shù)較低的為亞麻酸（4.64%）、油酸（5.78%）、果實橫徑（7.92%）、縱徑（8.15%）、果型指數(shù)（8.04%）。包裹種仁果皮百粒質(zhì)量及種仁百粒質(zhì)量變異較大表明與產(chǎn)量相關(guān)性狀變異豐富，亞麻酸、油酸和果型指數(shù)變異系數(shù)較小表明遺傳特性較穩(wěn)定。

表2 杜仲果實主要性狀統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of fruit traits of Eucommia ulmoides germplasms

19 個性狀表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，遺傳多樣性指數(shù)（H）介于1.6572～2.0947，平均值為2.0234，其中，杜仲橡膠（2.0947）、粗脂肪（2.0896）、種仁縱徑（2.0765）、亞麻酸（2.0762）、果實橫徑（2.0749）、油酸（2.0707）等性狀遺傳多樣性指數(shù)較大，表明這些性狀在每一級中的分布比較均勻，出仁率（1.6572）、種仁橫徑（1.8426）、種仁體積指數(shù)（1.9531）遺傳多樣性指數(shù)較小，表明這幾個性狀在表現(xiàn)型上分布不均勻。

3.2 不同來源杜仲種質(zhì)果實性狀分析

不同來源杜仲果實19 個性狀平均值、標準差和多重比較結(jié)果（表3）表明：除果實縱徑、種仁橫徑、種仁體積指數(shù)外，其它性狀在不同來源間均存在差異。福建杜仲資源果實縱徑、橫徑、側(cè)徑、果實體積指數(shù)、果實百粒質(zhì)量、種仁橫徑、種仁體積指數(shù)、包裹種仁果皮百粒質(zhì)量最大，杜仲橡膠含量最高，但出仁率最低；陜西杜仲資源的果型指數(shù)、種仁縱徑、種型指數(shù)最大，杜仲橡膠含量和油酸含量最低；吉林杜仲資源種仁百粒質(zhì)量最大，出仁率最高；安徽杜仲資源果實百粒質(zhì)量、種仁百粒質(zhì)量最??；粗脂肪含量云南資源最低，吉林資源最高；亞麻酸含量安徽資源最高，四川資源最低，油酸含量四川資源最高，亞油酸含量湖北資源最高。

表3 不同來源地杜仲果實性狀比較（均值 ± 標準差）Table 3 Comparison of fruit traits from different origin among Eucommia ulmoides germplasms (Mean ± SD)

續(xù)表 3

3.3 果實性狀間相關(guān)性分析

對19 個果實性狀進行相關(guān)性分析，表4 表明：19 個性狀間存在不同程度的相關(guān)性，且多數(shù)性狀間表現(xiàn)為顯著或極顯著相關(guān)。果實百粒質(zhì)量與果實縱徑（0.611）、橫徑（0.694）、側(cè)徑（0.423）、果實體積指數(shù)（0.750）、種仁體積指數(shù)（0.599）、種仁百粒質(zhì)量（0.701）等性狀呈極顯著正相關(guān)，說明果實體積指數(shù)和種仁百粒質(zhì)量對杜仲果實質(zhì)量的貢獻率最大。果型指數(shù)與種型指數(shù)呈極顯著正相關(guān)（0.463），果實體積指數(shù)與種仁體積指數(shù)呈極顯著正相關(guān)（0.591），說明果實與種仁大小表現(xiàn)出一致性。杜仲橡膠含量與包裹種仁果皮百粒質(zhì)量（0.822）、果實側(cè)徑（0.154）均呈極顯著正相關(guān)，推測與杜仲膠絲大量存在于果皮中包裹種仁部分有關(guān)，杜仲橡膠含量與種仁粗脂肪含量呈顯著負相關(guān)（?0.116），推測杜仲橡膠與粗脂肪合成存在一定程度的競爭關(guān)系。此外，亞麻酸含量與油酸（?0.730）、亞油酸（?0.871）呈極顯著負相關(guān)，推測亞麻酸與油酸、亞油酸合成過程中有一定程度的競爭關(guān)系。

表4 杜仲果實主要性狀相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of fruit traits of Eucommia ulmoides germplasms

3.4 基于果實性狀的聚類分析

采用歐式平方距離ward 法對19 個性狀進行聚類分析，在歐氏距離為5 時，331 份杜仲種質(zhì)可分為3 個類群，所劃分類群與地理來源關(guān)系較小，各類群性狀特征見表5。第Ⅰ類群有97 份種質(zhì)，其果實縱徑和橫徑均最小，歸為小果型類群，果實百粒質(zhì)量平均僅7.05 g；第Ⅱ類群有182 份種質(zhì)，其果實縱徑和橫徑介于第Ⅰ類群和第Ⅲ類群之間，為中型果類群，果實百粒質(zhì)量平均8.32 g；第Ⅲ類群有52 份種質(zhì)，其果實縱徑和橫徑最大，為大果型類群，果實百粒質(zhì)量平均達9.59 g。各性狀在3 個類群中均表現(xiàn)出不同程度的變異，第Ⅰ類群的變異系數(shù)為4.50%～26.62%，第Ⅱ類群的變異系數(shù)為4.87%～25.34%，第Ⅲ類群的變異系數(shù)為4.08～25.93%；亞麻酸含量在3 個類群中變異系數(shù)最小，包裹種仁果皮百粒質(zhì)量和種仁百粒質(zhì)量在3 個類群中變異系數(shù)較大。3 個類群間果型指數(shù)、種型指數(shù)、出仁率、杜仲橡膠含量、亞麻酸、油酸、亞油酸差異不顯著，其它性狀中，第Ⅲ類群果實縱徑、橫徑、側(cè)徑、果實體積指數(shù)、果實百粒質(zhì)量、種仁縱徑、側(cè)徑、種仁體積指數(shù)、種仁百粒質(zhì)量均極顯著高于第Ⅰ和第Ⅱ類群，種仁橫徑、包裹種仁果皮質(zhì)量、粗脂肪含量在第Ⅱ和第Ⅲ類群間差異不顯著，但均極顯著高于第Ⅰ類群。

表5 不同類群主要性狀比較Table 5 Comparison of main traits among three groups

3.5 果用杜仲優(yōu)良種質(zhì)篩選

3.5.1 杜仲果實性狀主成分分析 對19 個杜仲果實性狀進行主成分分析，結(jié)果（表6）顯示：前7 個主成分累積貢獻率達85.169%，表明前7 個主成分代表了杜仲果實性狀的大部分信息，因此，選取前7 個主成分對果用杜仲種質(zhì)進行評價。第1 主成分貢獻率最大，為24.334%，決定第1 主成分的為果實百粒質(zhì)量（FrW）、果實體積指數(shù)（FVI）、果實縱徑（FVD）、果實橫徑（FHD）及種仁縱徑（SVD），說明第1 主成分主要與果實產(chǎn)量相關(guān)；第2 主成分貢獻率為12.671%，決定第2 主成分的為亞麻酸（C18:3）、亞油酸（C18:2）及油酸（C18:1）含量，說明第2 主成分主要與亞麻酸油為主的脂肪酸含量相關(guān)；第3 主成分貢獻率為10.917%，決定第3 主成分的為種仁橫徑（SHD）、種仁體積指數(shù)（SVI）及種型指數(shù)（SSI），說明第3 主成分主要與種仁大小和形態(tài)有關(guān)；第4 主成分貢獻率為9.677%，果型指數(shù)（FSI）的特征向量值最高，主要與果實形態(tài)相關(guān)；第5 主成分貢獻率為9.604%，特征向量值最大的為包裹種仁果皮百粒質(zhì)量（FPW）和杜仲橡膠含量（EUR），表明第5 主成分重點表征了杜仲橡膠產(chǎn)出能力；第6 主成分貢獻率為9.018%，出仁率（SKC）、種仁百粒質(zhì)量（SKW）的特征向量值較大，表明第6 主成分重點表征種仁油脂產(chǎn)出能力；第7 主成分貢獻率為8.949%，決定第7 主成分的為果實側(cè)徑（FLD）、種仁側(cè)徑（SLD）及粗脂肪含量（CF）。3.5.2 杜仲果實性狀綜合評價 經(jīng)主成分分析提取了7 個主成分，計算331 份杜仲種質(zhì)在各主成分的得分及綜合得分，篩選出前10 名表現(xiàn)最優(yōu)種質(zhì)（表7）。第1 主成分排名前10 的種質(zhì)編號為10129C、10269C、10588C、10531C、10221C、10599C、11065C、10596C、10159C、10095C，這些種質(zhì)來自北京、河南和福建，果實產(chǎn)量性狀較優(yōu)；第2 主成分表征亞麻酸為主的脂肪酸性狀，排名前10 的種質(zhì)編號為11028C、10183C、10034C、10233C、10467C、10504C、10037C、10171C、10150C、10043C，這些種質(zhì)來自四川、北京、廣西、河南、湖南；第5 主成分排名前10 的種質(zhì)為10513C、10229C、10166C、10209C、10504C、10049C、10508C、14001C、10526C、10029C，這些種質(zhì)來自河南、北京、河北、江西，杜仲橡膠產(chǎn)出能力表現(xiàn)較好；第6 主成分排名前10 的種質(zhì)為10055C、11044C、10246C、10129C、10124C、10143C、10588C、10508C、10133C、11049C，這些種質(zhì)來自河北、吉林、北京、河南、山西，種仁油脂產(chǎn)出能力較高；綜合評價前10 的種質(zhì)編號為10129C、10508C、10588C、10580C、10043C、10531C、10035C、10152C、11065C、10596C，最優(yōu)的種質(zhì)來自北京萬泉河路，其次是河南洛陽，河南洛陽有3 份種質(zhì)入選。部分優(yōu)異種質(zhì)照片見圖1。

圖1 杜仲優(yōu)異種質(zhì)Fig.1 Excellent germplasms of Eucommia ulmoides

表6 19 個性狀前7 個主成分的特征向量、特征值、貢獻率及累積貢獻率Table 6 Power vector(PV),eigenvalues(E),contribution rate(CR) and cumulative contribution rate(CCR)of first seven principal components(PC) based on 19 traits

表7 杜仲種質(zhì)主成分得分和綜合得分Table 7 Principal component scores and overall scores of Eucommia ulmoides germplasms

4 討論

表型變異是遺傳變異最直接的表現(xiàn)，是遺傳和環(huán)境相互作用的結(jié)果。杜仲為第四紀冰川侵襲后僅留存于我國的孑遺樹種，在長期進化過程中，產(chǎn)生了豐富的變異。選用果實進行表型性狀遺傳變異研究，可以在一定程度上反映不同來源種質(zhì)的變異大小和遺傳多樣性水平[20]。周強等[5]研究發(fā)現(xiàn)，湘西地區(qū)杜仲翅果性狀存在較大變異，果實形態(tài)性狀變異系數(shù)為5.9%～22.6%，遺傳變異較大；魏艷秀[21]通過對杜仲果實形態(tài)性狀的測定，發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)遺傳多樣性指數(shù)為2.04～2.09，表現(xiàn)出豐富的多樣性。本研究通過對331 份杜仲種質(zhì)資源果實19 個性狀測定分析，發(fā)現(xiàn)杜仲種質(zhì)資源果實性狀表現(xiàn)出豐富的多樣性，19 個性狀遺傳多樣性指數(shù)平均值為2.0234，杜仲橡膠含量遺傳多樣性指數(shù)最大（2.0947），其次是粗脂肪（2.0896）；變異系數(shù)平均值為12.65%，以果實百粒質(zhì)量、包裹種仁果皮百粒質(zhì)量和種仁百粒質(zhì)量為代表的經(jīng)濟性狀表現(xiàn)出15.20%～25.79%的變異幅度，而亞麻酸、油酸、果型指數(shù)等性狀的變異系數(shù)較小，可能是這些性狀表現(xiàn)較穩(wěn)定。杜仲果實豐富的表型變異為優(yōu)良資源選育提供了可能。對不同來源杜仲果實性狀分析發(fā)現(xiàn)，除果實縱徑、種仁橫徑、種仁體積指數(shù)外，其它性狀在不同來源間均存在差異。

通過對杜仲果實性狀相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，杜仲果實重要經(jīng)濟性狀杜仲橡膠含量與包裹種仁果皮百粒質(zhì)量、果實側(cè)徑呈極顯著正相關(guān)，魏艷秀[21]也得到了類似的結(jié)論，表明果實側(cè)徑可以作為篩選優(yōu)異種質(zhì)的重要參考指標；而杜仲橡膠含量與種仁粗脂肪含量呈顯著負相關(guān)，表明杜仲橡膠含量與油脂的積累存在一定程度的競爭關(guān)系，這與周強等[5]研究結(jié)果相異，可能由于材料來源及樣本數(shù)不同。亞麻酸含量與亞油酸呈極顯著負相關(guān)，因此，在評價杜仲籽油品質(zhì)時，應綜合考慮亞麻酸與亞油酸的總和。

聚類分析可將性狀相似的種質(zhì)聚為一類，更好地分析各種質(zhì)特點，對優(yōu)良種質(zhì)篩選和資源利用有較好指導作用。本研究將331 份杜仲種質(zhì)劃分為3 個類群，3 個類群不同性狀表現(xiàn)出明顯差異，第Ⅲ類群果實最大，平均果實百粒質(zhì)量達9.59 g，杜仲橡膠含量和亞麻酸含量分別為16.09%和59.51%，均為3 個類群中最高，具有篩選高產(chǎn)、高質(zhì)量優(yōu)良品種的潛力；同時，發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)在地理分布上呈現(xiàn)混雜分布，表明我國杜仲種質(zhì)資源分布無明顯地理變異趨勢，可能與杜仲較強的適應性和長期的引種栽培活動有關(guān)。

國內(nèi)關(guān)于杜仲優(yōu)良種質(zhì)評價篩選工作開展較早，張博勇等[22]結(jié)合有效成分、生長量等指標篩選出了藥用杜仲優(yōu)良無性系；杜紅巖等[23]、杜慶鑫等[24]、慶軍等[14]先后篩選出橡膠用、雄花用、葉用杜仲優(yōu)良無性系；周強等[5]針對湘西地區(qū)杜仲種質(zhì)資源果實性狀進行了評價，篩選了杜仲膠和油脂含量高的資源；于靖[15]對不同產(chǎn)地、不同基因型杜仲種仁脂肪酸及果皮杜仲膠含量進行了分析評價。但針對果用杜仲優(yōu)良種質(zhì)篩選存在樣本量少、評價性狀不全面等問題。本研究收集我國18 個?。ㄊ校┕?31 份杜仲種質(zhì)資源，涵蓋了我國杜仲種質(zhì)資源大部分類型，包含種質(zhì)資源信息十分豐富。本研究基于杜仲果實表型性狀，采用主成分分析法，提取了7 個主成分，并對杜仲種質(zhì)進行評價。針對油用、橡膠用和綜合利用等不同用途分別篩選出10 份最優(yōu)種質(zhì)。經(jīng)綜合評價篩選的前10 份最優(yōu)種質(zhì)為10129C、10508C、10588C、10580C、10043C、10531C、10035C、10152C、11065C、10596C，且有7 份屬于第Ⅲ類群大果型群體，與聚類分析結(jié)果相近，在今后育種及開發(fā)利用時可作為優(yōu)選材料著重考慮。

5 結(jié)論

杜仲種質(zhì)資源果實性狀存在不同程度的變異和豐富的多樣性，以包裹種仁果皮百粒質(zhì)量和種仁百粒質(zhì)量為代表的產(chǎn)量指標變異最大，為杜仲良種選育提供了充足的資源。亞麻酸、油酸、果型指數(shù)等性狀變異系數(shù)較小，果實形態(tài)較穩(wěn)定。杜仲橡膠含量與種仁粗脂肪含量呈顯著負相關(guān)，表明對杜仲橡膠合成過程投入的增加要以減少對種仁油脂積累的投入為代價。聚類分析將杜仲種質(zhì)劃分為3 個類群，類群間不同性狀差異明顯，但不同種質(zhì)無明顯地理變異趨勢。針對不同用途分別篩選出10 份最優(yōu)種質(zhì)，為我國杜仲良種選育及綜合利用提供了優(yōu)異的種質(zhì)基礎。