蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基發(fā)酵生產(chǎn)生物飼料試驗(yàn)

王艷華 郭玲玲

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽(yáng) 122000）

蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris，又稱北蟲(chóng)草，與野生冬蟲(chóng)夏草同屬肉座菌目[1]。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，蛹蟲(chóng)草是冬蟲(chóng)夏草的重要人工替代品之一，其在降血脂，防治動(dòng)脈硬化，保護(hù)心、腦組織，鎮(zhèn)靜催眠，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性，抗癌、抗炎、抗菌、抗缺氧等方面具有良好功效[2-3]。

目前蛹蟲(chóng)草在中國(guó)已經(jīng)形成了一個(gè)較大的產(chǎn)業(yè)，年產(chǎn)值達(dá)100億元[4]。但數(shù)量巨大的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基未能充分利用，大部分被扔掉，既浪費(fèi)資源又造成環(huán)境污染。因此加強(qiáng)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基綜合利用的研究具有重要經(jīng)濟(jì)、生態(tài)價(jià)值。

蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基以小麥為主，采收蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基含有大量的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪、無(wú)機(jī)鹽及微量元素、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖等[5，6]。培養(yǎng)殘基經(jīng)微生物(酵母菌和芽孢桿菌）分解利用，產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等消化酶，粗纖維含量降低，含有豐富的氨基酸及酸類、醇類、酯類等芳香物質(zhì)，適口性改善，同時(shí)可長(zhǎng)期保存[7]。

目前利用蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基直接飼喂動(dòng)物的試驗(yàn)較多，用其微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物飼料的研究甚少。為此筆者進(jìn)行黑曲霉、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基試驗(yàn)，以期篩選出利用蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基生產(chǎn)生物飼料較佳的發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑曲霉Aspergillus nige，編號(hào)LW-09；釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，編號(hào)LY-11；枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，編號(hào)LS-08，均為遼寧省微生物科學(xué)研究院菌種保藏中心保藏菌株。蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基由遼寧省朝陽(yáng)市喀喇沁左翼蒙古族自治縣平房鎮(zhèn)雙廟村北蟲(chóng)草培育基地提供，為小麥培養(yǎng)殘基。其含粗蛋白16.36%，粗脂肪4.41%，淀粉43.85%，粗纖維4.67%，粗灰分3.39%；活性成分多糖45.01 mg/g，蟲(chóng)草素3.29 mg/g，腺苷4.63 mg/g，硒0.132 mg/g，微量元素鈣、磷等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選原料配比、菌種配比、接種總量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間以確定培養(yǎng)工藝。將固體物料按照121℃、60 min保溫滅菌后降至室溫，將營(yíng)養(yǎng)鹽提前用少量無(wú)菌水溶解，按水分含量拌勻，將培養(yǎng)好的液體菌種按一定比例接入滅菌冷卻后的物料中，鋪于培養(yǎng)屜上，保證屜底部透氣，恒溫恒濕固態(tài)培養(yǎng)?；A(chǔ)發(fā)酵條件：物料配比為蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基∶麩皮=65∶35，硫酸銨1.5%，磷酸二氫鉀1%，硫酸鎂0.50%，料含水量55%；菌種配比為1∶1∶1；接種總量為8%(菌種配比試驗(yàn)除外）；培養(yǎng)溫度為30℃；培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

1.2.2 液體菌種培養(yǎng)方法

1.2.2.1 黑曲霉液體菌種培養(yǎng)

200 g土豆，25 g葡萄糖，15 g酵母膏，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，pH為6.5。搖瓶裝液量為100 mL，8層紗布及報(bào)紙包扎封口，121℃，高壓滅菌25 min。冷卻至25℃以下，接種大小2 cm×3 cm左右的斜面菌種2～3塊，28℃，160 r/min搖床培養(yǎng)36 h，備用。

1.2.2.2 釀酒酵母液體菌種培養(yǎng)

蛋白胨20 g，酵母抽提物10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH為6.5。裝液量為100 mL/500 mL，8層紗布及報(bào)紙包扎封口，121℃，高壓滅菌25 min。冷卻至25℃以下，接種2 cm×3 cm左右大小的斜面菌種2～3塊，30℃，160 r/min搖床培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2.3 枯草芽孢桿菌液體菌種培養(yǎng)

葡萄糖15 g，蛋白胨15 g，氯化鈉5 g，牛肉膏0.5 g，蒸 餾 水1 000 mL，pH 7.0。裝 液 量 為100 mL/500 mL，8層紗布及報(bào)紙包扎封口，121℃，高壓滅菌25 min。冷卻至25℃以下，接種2 cm×3 cm左右大小的斜面菌種2～3塊，37℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，備用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

粗蛋白質(zhì)測(cè)定按照GB/T 6432—2018，纖維素酶活性按照GB/T 23881—2009，蛋白酶活性按照GB/T 28715—2012，粗脂肪測(cè)定按照GB/T 6433—2006，粗纖維測(cè)定按照GB/T6434—2006[8]，淀粉測(cè)定按照GB/T 20194—2018，粗灰分測(cè)定按照GB/T 6 438～92，鈣測(cè)定按照GB/T 6436—2018，磷測(cè)定按照GB/T 6437—2018，細(xì)胞數(shù)測(cè)定采用生物學(xué)活菌計(jì)數(shù)法，多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法，蟲(chóng)草素及腺苷含量測(cè)定采用高效液相色譜法，硒含量的測(cè)定按照GB 5009.93—2017[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵物料蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基與麩皮配比對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖1可知，物料中蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基占比45%～75%時(shí)菌體生長(zhǎng)情況(細(xì)胞數(shù)及菌體蛋白）及其他各項(xiàng)指標(biāo)均較好，殘基占比75%時(shí)粗蛋白含量最高，說(shuō)明此時(shí)的物料配比較利于菌體蛋白的增加及無(wú)機(jī)氮源的轉(zhuǎn)化，殘基占比45%時(shí)纖維素酶及蛋白酶酶活性較高，說(shuō)明增加麩皮有利于提高纖維素酶及蛋白酶活性，但超過(guò)45%時(shí)酶活性不再上升。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，確定培養(yǎng)殘基∶麩皮為65∶35為最佳，發(fā)酵料粗蛋白含量為36.27%，每克發(fā)酵料細(xì)胞數(shù)為51.76億，纖維素酶活性、蛋白酶酶活性分別為338.09 U/g、359.57 U/g。

圖1 蛹蟲(chóng)草殘基配比對(duì)發(fā)酵效果的影響

2.2 菌種配比、接種總量對(duì)發(fā)酵效果的影響

接種總量按12%加入，菌齡為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌種配比對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響見(jiàn)圖2。結(jié)果表明3個(gè)菌種的配比對(duì)發(fā)酵結(jié)果有明顯的影響，黑曲霉∶釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌為1∶3∶2時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)總體情況較好，此時(shí)粗蛋白含量及細(xì)胞數(shù)均最高；菌種比例為3∶2∶1時(shí)纖維素酶活性、蛋白酶酶活性最高。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，最終確定黑曲霉∶釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌比例以1∶3∶2為宜，發(fā)酵料細(xì)胞數(shù)及粗蛋白含量最高，同時(shí)相應(yīng)的2種酶活性也較高。

圖2 菌種配比對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖3可知，接種總量為10%時(shí)，發(fā)酵料各指標(biāo)最好，高于此接種總量，各指標(biāo)沒(méi)有明顯上升，接種總量為18%時(shí)各指標(biāo)稍現(xiàn)下降趨勢(shì)，之后下降明顯，說(shuō)明過(guò)高的接種總量反而產(chǎn)生負(fù)面效果。綜合考慮生產(chǎn)成本及發(fā)酵效果，確定10%為最合適的接種總量。

圖3 接種總量對(duì)發(fā)酵效果的影響

2.3 培養(yǎng)（發(fā)酵）起始溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖4可知，培養(yǎng)(發(fā)酵）起始溫度30℃為最佳培養(yǎng)溫度，在此溫度條件下3個(gè)菌種都能夠良好生長(zhǎng)，早期枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，但隨著培養(yǎng)料發(fā)酵產(chǎn)熱，料溫上升，發(fā)酵耗氧而造成物料相對(duì)缺氧，枯草芽孢桿菌也很快生長(zhǎng)繁殖，3個(gè)菌株生長(zhǎng)相輔相成，形成良好共生狀態(tài)。

圖4 發(fā)酵起始溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

2.7 培養(yǎng)（發(fā)酵）時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響

蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基與麩皮的配比為65∶35，各菌種添加比例為1∶3∶2，接種總量為10%，培養(yǎng)(發(fā)酵）起始溫度30℃，從發(fā)酵開(kāi)始，每隔4 h取樣一次，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

由圖5知，隨著培養(yǎng)(發(fā)酵）時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵料細(xì)胞數(shù)、粗蛋白、纖維素酶、蛋白酶隨之上升，至60 h左右時(shí)，細(xì)胞數(shù)、粗蛋白達(dá)最高值，分別為53億/g、38%，此后不再隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而大幅上升；培養(yǎng)64 h時(shí)纖維素酶、蛋白酶活性達(dá)最高值，分別為363 U/g、374U/g。綜合發(fā)酵料4個(gè)指標(biāo)確定培養(yǎng)60～64 h較適宜。

圖5 培養(yǎng)（發(fā)酵）時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響

3 小結(jié)與討論

利用黑曲霉、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵蛹蟲(chóng)草殘基單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)酵物料配比為培養(yǎng)殘基∶麩皮65∶35，菌種配比1∶3∶2，接種總量10%，發(fā)酵(起始）溫度30℃，培養(yǎng)(發(fā)酵）時(shí)間60～64 h，發(fā)酵效果較好。發(fā)酵料飼喂蛋雞試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋雞日糧中添加蛹蟲(chóng)草殘基發(fā)酵飼料對(duì)蛋雞的生產(chǎn)性能有顯著的影響(另文發(fā)表）。

試驗(yàn)為利用蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基開(kāi)發(fā)生物飼料提供了數(shù)據(jù)支持。