煙草根際促生菌的分離鑒定及抗菌、促生特性

鐘 釧，高 峻，凌愛芬*，陳 強(qiáng)，趙 珂，孟 霖

(1.四川省煙草公司涼山州公司會(huì)東分公司；四川 西昌 615200；2.四川省煙草公司涼山州公司，四川 西昌 615200；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都 溫江 611130；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東 青島 266101)

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，四川省是全國(guó)的產(chǎn)煙大省，全省煙草種植主要分布在涼山、攀枝花、瀘州、宜賓和廣元五大煙區(qū)。其中，涼山州煙區(qū)地處川西南橫斷山系東北緣，具備得天獨(dú)厚的自然條件，生產(chǎn)的煙葉氣味清香獨(dú)特，屬于西南高原生態(tài)區(qū)-清甜香型，是優(yōu)質(zhì)煙葉發(fā)展最適宜區(qū)之一[1-2]。然而隨著植煙年限的增加，已出現(xiàn)煙葉植煙土壤環(huán)境變差、土壤養(yǎng)分供給失衡、煙葉質(zhì)量下降以及烤煙生產(chǎn)效益下降等問題[3]。植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizomicrobe，PGPR)是一類定植于植物根部并對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生積極影響的微生物群，可提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在根際的積累、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抑制病原微生物的危害及提高植物抗逆能力等一類有益微生物[4]。因此，因地制宜地篩選與當(dāng)?shù)刂矡熎贩N相匹配的PGPR菌，為進(jìn)一步研發(fā)煙草專用全元微生物肥料提供優(yōu)良菌種，是確保植煙土壤的“提質(zhì)增效”的一個(gè)有效途徑。

放線菌是土壤微生物的重要組成部分，大量的研究表明根際放線菌能通過分泌吲哚乙酸(IAA)、產(chǎn)鐵載體、溶磷、固氮等方式提供植物可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)通過產(chǎn)具有抗菌的活性物質(zhì)以及產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶等拮抗病原微生物，提高植物的抗逆性[5]。此外，大多數(shù)放線菌是能產(chǎn)生孢子的，這些孢子均具有較強(qiáng)的抗逆性，能在不利的環(huán)境下長(zhǎng)期存活。因此，本研究以涼山煙區(qū)烤煙根際土壤為研究對(duì)象，分離烤煙根際土壤中的放線菌，并研究各菌株的促生和抗菌功能，篩選出具有應(yīng)用前景的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和材料

試驗(yàn)于2019年6月在冕寧植煙區(qū)進(jìn)行，其試驗(yàn)地貌類型以山地為主，土壤類型為紅壤，基本理化性質(zhì)：pH 5.6，有機(jī)質(zhì)23.79g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為53.55mg/kg，41.5mg/kg，172mg/kg，烤煙品種為云煙87。分別確定2～3個(gè)代表性煙田，在每個(gè)代表性煙田中采集旺長(zhǎng)期4～6顆健康煙株，將煙株從煙田中小心拔出，輕輕抖掉根系上多余的土壤(非根際土壤)后，將煙株放入無(wú)菌塑料袋，保存于4℃冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行分離。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配置 分離培養(yǎng)基[6]：高氏一號(hào)，加入制霉菌素30mg/L，重鉻酸鉀30mg/L；選培養(yǎng)基：LB、PDA，菌株純化、活化、保藏培養(yǎng)基：高氏一號(hào)培養(yǎng)基。菌株促生作用篩選試劑：IAA顯色液、CAS檢測(cè)液、蒙金娜培養(yǎng)基均參考廖萍等[7]方法進(jìn)行配制。所用試劑為分析純，均購(gòu)于生工生物工程上海(股份)有限公司。

1.2.2 植物內(nèi)生放線菌分離、純化、鑒定 將采集到的煙株根部切下，放入裝有無(wú)菌水的三角瓶中于180rmp/min的搖床上處理30min收集根際土壤，并作10-1、10-2、10-3梯度稀釋，取100μl懸液均勻涂布于分離培養(yǎng)基上，放入28℃隔水式培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待放線菌長(zhǎng)出后，用高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行菌落純化，并將純化好的菌株保種于ISP4斜面培養(yǎng)基上，4℃保存?zhèn)溆?。觀察菌落的外部形態(tài)如：氣絲、基絲、產(chǎn)生色素的顏色及擴(kuò)散方式、有無(wú)孢子產(chǎn)生、是否吐水等情況。接種菌株于高氏一事情培養(yǎng)基埋片培養(yǎng)710d，革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡(Zeiss Axio Imager)觀察菌絲形態(tài)[8]。

1.2.3 放線菌抗菌活性檢測(cè) 指示菌株：青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)，煙草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)、煙草赤星病病菌(Alternariaalternata)，由本實(shí)驗(yàn)室自行分離保存。供試放線菌菌株抗菌活性檢測(cè)參照李靜等[9]方法進(jìn)行。

1.2.4 放線菌促生能力檢測(cè) 放線菌菌株產(chǎn)IAA能力測(cè)定參考GORDON等[10]方法進(jìn)行，定量測(cè)定菌株產(chǎn)鐵載體能力參照SHI[11]的方法進(jìn)行。溶磷能力檢測(cè)：將供試菌株接種到PKO培養(yǎng)基上，每株菌重復(fù)3次，置于28 ℃培養(yǎng)7d，觀察有無(wú)解磷圈及解磷圈的大小。

1.2.5 放線菌對(duì)煙草促生效果分析 以煙草為研究對(duì)象，根據(jù)促生結(jié)果選擇綜合效果較好的菌株SA129、SA133進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)以初步探究放線菌對(duì)煙草的促生效果。供試土壤采自涼山州冕寧縣典型煙田，每盆裝土約2.5kg。設(shè)置3個(gè)處理：接菌株SA129，接菌株SCAU133和不接菌株(CK)。采用漂浮盤方法進(jìn)行烤煙育苗(品種為云煙87)，待長(zhǎng)出35片真葉后移栽到盆中，每盆栽煙1株，澆灌約50mL放線菌菌懸液(3.8×108CFU/mL)[12]，CK灌溉50mL無(wú)菌水，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。待煙草生長(zhǎng)至旺長(zhǎng)期(50～60d)，通過EPSON1680根系掃描儀(Epsn，LongBeach，USA)對(duì)煙株根系進(jìn)行掃描，用WinRhizo2005a根系分析軟件分析[13]，獲得根系總根長(zhǎng)、總根表面積、平均根系直徑、根尖數(shù)、分支數(shù)等形態(tài)指標(biāo)，同時(shí)測(cè)量煙草植株的株高、莖圍、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、有效葉片數(shù)、植株鮮重、植株干重、地上部分長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)算統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 代表菌株16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 提取代表菌株DNA[14]，選用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物(8-27F、1504-1523R)[15]對(duì)甘草內(nèi)生放線菌的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送往生工生物工程上海(股份)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序獲得的16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，用Clustal X(Version1.81)進(jìn)行序列的多重比對(duì)分析，MEGA 6.0軟件采用鄰(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[16]，確定放線菌的分類地位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 煙草根際放線菌的分離、純化

從煙草根際土壤中共分離獲得23株菌，通過觀察菌株菌絲、孢子形態(tài)，及培養(yǎng)特征，如氣生菌絲的顏色、基內(nèi)菌絲的顏色、色素產(chǎn)生情況等，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。菌株在顯微鏡下表現(xiàn)出絲狀菌絲和鏈狀孢子絲，為典型的放線菌形態(tài)，確定所分離獲得的23株菌均為放線菌。

2.2 煙草根際放線菌抗菌活性篩選

對(duì)煙草根際放線菌抗菌活性篩選結(jié)果表明，分離出的23株菌株中有56.5%的放線菌對(duì)供試的至少一種煙草上常見的病原真菌具有不同程度的抗性(表1)，有5個(gè)株菌對(duì)供試的3種煙草病原真菌均具有抑菌活性，11個(gè)株菌對(duì)青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)具有抑菌活性，10個(gè)株菌對(duì)煙草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)具有抑菌活性，7個(gè)株菌對(duì)煙草赤星病病菌(Alternariaalternata)具有抑菌活性，但不同菌株對(duì)不同病原菌的拮抗效果存在差異。以上結(jié)果表明，分離自煙草根際的放線菌所產(chǎn)生代謝產(chǎn)物具有多樣性，對(duì)煙草常見的病原真菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性。

2.3 煙草根際放線菌促生能力

對(duì)23株煙草根際放線菌促生功能進(jìn)行檢測(cè)(表1)，測(cè)得所有放線菌都能產(chǎn)生IAA，但產(chǎn)IAA的能力有差異，產(chǎn)IAA濃度范圍為10.92～68.15mg/L，菌株SA133和SA129產(chǎn)IAA濃度較高，分別為68.92mg/L和54.92mg/L。將23株菌接種到CAS平板上，所有菌株菌落周圍均出現(xiàn)黃色暈圈，其中菌株SA124、SA129、SA131和SA133產(chǎn)生了2mm以上的水解圈；7個(gè)菌株在PKO平板上出現(xiàn)解磷水解圈，且水解圈均小10mm；11個(gè)株菌(47.82%)具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力；菌株SA122、SA123、SA129、SA131和SA133同時(shí)具有以上4種促生功能。

表1 煙草根際放線菌抗菌促生活性

2.4 盆栽試驗(yàn)

根據(jù)對(duì)23株煙草根際放線菌抗菌和促生功能的分析結(jié)果(表2)，菌株SA129和SA133被選作供試菌株，通過盆栽實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)煙草是否有促生作用。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株SA129、SA133和SA129+SA133混菌處理對(duì)煙草的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)(表3)。與對(duì)照組相比，菌株SA129、SA133和SA129+SA133處理后的煙草株高、總根長(zhǎng)、總根面積、平均根系直徑、總根體積、總根毛數(shù)等指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而SA129+SA133混菌處理后的煙草株高、總根長(zhǎng)、總根面積、平均根系直徑、總根體積、總根毛數(shù)分別為42.49cm、8019.34cm、1385.34cm2、1.734mm、15.13cm3、15472個(gè)，其促生效果又顯著高于單菌株處理組，表明分離自煙草根際的放線菌可以促進(jìn)煙草根系的生長(zhǎng)，其中復(fù)合菌系對(duì)煙草植株生長(zhǎng)的促進(jìn)效果最佳。

表2 煙草植株的根系形態(tài)特征

2.5 菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

用于盆栽試驗(yàn)的2株菌經(jīng)16SrRNA基因測(cè)序分析后基于16SrRNA基因序列構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。菌株SA129和SA133與對(duì)應(yīng)相似性最高的菌株同源性為99%100%，均為鏈霉菌屬(Streptomyces)。

圖1 煙草根際放線菌16S RNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育N-J樹

3 討論

放線菌廣泛分布不同的自然生態(tài)環(huán)境中，種類多，數(shù)量大，能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，是一類具有巨大實(shí)用價(jià)值的微生物資源。已有的研究發(fā)現(xiàn)，分離自植物根際的放線菌不僅能產(chǎn)生具有抑菌的活性物質(zhì)，還能分泌植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和抑制植物病害的發(fā)生[17-18]。煙草根際土壤中分布著大量有益微生物類群，有關(guān)根際細(xì)菌的分離促生效果已有相關(guān)報(bào)道[19-22]，但有關(guān)煙草根際放線菌的研究卻鮮有報(bào)道僅見羅文建等[23]從煙草根際中分離獲得了對(duì)青枯雷爾氏菌具有拮抗作用的放線菌。

本研究對(duì)分離自煙草根際土壤的23株放線菌進(jìn)行促生功能評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，所有放線菌菌株均能分泌IAA和產(chǎn)鐵載體的能力，30%的菌株具有溶磷能力，47.83%的菌株具產(chǎn)幾丁質(zhì)的能力。此外，23株供試菌中有56.5%的放線菌對(duì)供試的至少一種煙草上常見的病原真菌表現(xiàn)出抗性，其中有21.7%的菌株對(duì)3種病原菌均有拮抗效果，表明在烤煙根際土壤中蘊(yùn)藏著豐富的具有促生拮抗功能的放線菌資源。

已有的研究結(jié)果表明，接種微生物菌劑改良土壤，維持根際微生物區(qū)系平衡，提高土壤肥力，增強(qiáng)作物抗逆性，提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)，特別是接種復(fù)合菌劑可充分發(fā)揮各菌株的優(yōu)勢(shì)，提升接種效果，促生抗病效果更佳[9,24-25]。劉春菊等[26]從煙草根際土壤分離獲得具有溶磷、抑菌、促生效果好的菌株CT45-1與草酸青霉QM-10混合施用均能提高烤煙對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善烤煙農(nóng)藝性狀，提高煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，并在一定程度上提高煙株的抗病性。吳秉江等[27]從煙株根際篩選出兩株生防細(xì)菌，接種烤煙后可誘導(dǎo)煙株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性(ISR)，增強(qiáng)對(duì)病害的防御能力，能有效的防治煙草黑脛病。徐同偉等[28]從黑脛病煙株的根際土壤中獲得了兩株對(duì)煙草黑脛病具有較好防治效果的芽孢桿菌，盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明接種生防菌株后對(duì)烤煙生長(zhǎng)具有明顯促生作用，其中復(fù)合菌系對(duì)煙草黑脛病的防治效果優(yōu)于單菌。本研究也得到了相似的研究結(jié)果，試驗(yàn)中所篩選到的促生拮抗綜合效果較果的放線菌菌株SA129、SA133和SA129+SA133接種煙苗盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單菌處理和混菌處理對(duì)煙草生長(zhǎng)均具有促進(jìn)作用，處理后的煙草在株高以及根的生長(zhǎng)水平上都顯著高于對(duì)照組，而混菌處理的效果又顯著高于單菌處理。導(dǎo)致單菌和混合菌接效果差異可能的原因是一方面可能是不同菌株在土壤中的定殖能力及促生機(jī)制不同，將多種菌株復(fù)合后，增加了接種菌在土壤中定殖效率，同時(shí)復(fù)合菌兼具IAA、鐵載體、溶磷和產(chǎn)幾質(zhì)酶的促生活性和對(duì)煙草常見病原菌的抑制作用，這些促生抗菌特性不同程度的刺激和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，能通過菌株間的協(xié)同作用增加植物對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，又提高煙草的抗病性，通過多種途徑協(xié)同作用促進(jìn)植物生長(zhǎng)，進(jìn)而達(dá)到促生煙草生長(zhǎng)的效果[29-30]。因此，放線菌SA129+SA133復(fù)合菌系在促進(jìn)煙草植物生長(zhǎng)方面具有一定的應(yīng)用前景，拓寬了烤煙抗病促生菌種資源的來源，為煙草專用微生物肥料的開發(fā)提供了菌種資源和理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從煙草根際土壤中分離獲得了23株放線菌，通過進(jìn)一步對(duì)菌株抗菌促生活性的篩選，獲得了具有較好抗菌促生效果的兩株鏈霉菌菌株SA133和SA129。煙草接種SA133和SA129菌株后，其株高、總根長(zhǎng)、總根面積、平均根系直徑、總根體積、總根毛數(shù)等指標(biāo)均顯著高于未接種處理組，且SA129+SA133混菌處理組顯著高于單菌處理組。試驗(yàn)結(jié)果表明，SA133和SA129具有抗菌、溶磷以及產(chǎn)IAA、鐵載體和幾丁酶的能力，能促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，具有較好的應(yīng)用前景。