蜂針蜇刺療法的鎮(zhèn)痛抗炎作用及對(duì)類風(fēng)濕大鼠脾臟組織切片的改變

倪珊，劉彥含，王瑛，楊萌萌

(黑龍江省森工總醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

蜂針蜇刺治療簡(jiǎn)稱蜂療，是以鑷子夾持蜜蜂，利用蜜蜂蜂針為工具，在中醫(yī)針灸理論的指導(dǎo)下，循經(jīng)絡(luò)皮部和穴位施行不同手法的針刺，將蜂毒的藥理作用與穴位的治療作用相結(jié)以防治疾病的方法稱為蜂針療法[1]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》記載：“蜂螯有毒可療疾”，在方以智《物理小識(shí)》卷五中，記述將蜂針制作“藥蜂針”的方法：“取黃蜂之尾針合硫煉，加水麝為藥。置瘡湯頭，以火點(diǎn)而灸之?！狈涠咀钤缡珍浻凇都种胁菟帯罚骸胺涠?，祛風(fēng)濕，治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎?！苯陙?lái)，隨著中醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展和政策的支持，不斷有臨床醫(yī)師在臨床上應(yīng)用蜂療來(lái)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2-5]。本研究以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，進(jìn)一步闡述蜂療對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠，SPF級(jí)，周齡7周左右，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(黑)2018-003，飼養(yǎng)環(huán)境溫濕度：室溫18～22 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

SD大鼠，SPF級(jí)，周齡8周左右，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(黑)2018-003，飼養(yǎng)環(huán)境溫濕度：室溫18～22℃，相對(duì)濕度為50%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要儀器及試劑

弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑(Sigma公司，批號(hào)：SLBQ2284V、SLBK1731V)；牛Ⅱ型膠原液(Chondrex公司，批號(hào)：190514)；醋酸(阿拉丁試劑上海有限公司)；二甲苯(阿拉丁試劑上海有限公司)；無(wú)水乙醇(中國(guó)國(guó)藥)；蘇木精(中國(guó)Solarbio)；曙紅Y-醇溶(中國(guó)sangon)；洛索洛芬鈉(第一三共制藥上海有限公司，批號(hào)：20191201)；分析天平；石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏)；超純水系統(tǒng)(香港Heal Force)；顯微鏡型號(hào)(日本OLUMPUS)；顯微鏡拍照系統(tǒng)(日本OLUMPUS)，MIKRO 200R離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

1.3.1 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn):雄性小鼠50只。禁食不禁水過(guò)夜。隨機(jī)分為5組(每組10只)：蜂針蜇刺30 s組、蜂針蜇刺1 min組、蜂針蜇刺5 min組、陽(yáng)性對(duì)照藥組(洛索洛芬鈉組，0.025 g/kg)和空白組(等體積溶劑)。給藥30 min后，0.8%的醋酸生理鹽水溶液，沿腹膜壁緩慢注入腹腔。記錄20 min內(nèi)，小鼠扭體次數(shù)。

1.3.2 抗炎實(shí)驗(yàn)

二甲苯致耳腫脹實(shí)驗(yàn):小鼠50只，雌雄各半。禁食不禁水過(guò)夜。隨機(jī)分為5組(每組雌雄各5只，共10只)：蜂針蜇刺30 s組、蜂針蜇刺1 min組、蜂針蜇刺5 min組、陽(yáng)性對(duì)照藥組(洛索洛芬鈉組，0.025 g/kg)和空白組(等體積溶劑)。給藥30 min后，在小鼠右耳正反面涂抹二甲苯20 μL。2.5 h后，處死小鼠，8 mm打孔器，打下小鼠左右耳，分析天平稱取重量,計(jì)算左右耳重量差值。

1.3.3 類風(fēng)濕實(shí)驗(yàn)

雄性SD大鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥組(洛索洛芬鈉組，0.009 g/kg)、蜂針(蜜蜂來(lái)源：意大利蜂，由黑龍江省森工總醫(yī)院蜂療室提供)治療組(5 min，1 min，30 s)，每組10只。二次免疫時(shí)開(kāi)始治療，空白對(duì)照組和模型組大鼠灌胃給與等體積蒸餾水。蜂針治療組取足三里、血海、腎俞、肝俞、脾俞穴，以75%酒精消毒所取得穴位，用鑷子輕輕捏住蜜蜂的腰部，對(duì)其尾部對(duì)準(zhǔn)穴位，讓其自然蟄入穴位并留針(30 s、1 min、5 min) 后，將毒刺拔除，每只活蜂只蟄1個(gè)穴位。蜂針治療每天1次，每次1針，每次治療取一個(gè)穴位，以上穴位輪流交替，共治療35 d。

1.4 造模方法

在冰水浴條件下，向含弗氏完全佐劑中離心管中緩慢滴加等體積的牛Ⅱ型膠原液(2 mg/mL)，用電動(dòng)勻漿器勻漿制備成乳濁液(含膠原1 mg/mL)。造模大鼠在尾根基部3個(gè)不同部位皮內(nèi)注射等體積的膠原乳濁液200 μL/只，進(jìn)行初次免疫。6 d后，同樣方法注射弗氏不完全佐劑乳濁液，進(jìn)行二次免疫，100 μL/只。二次免疫后，足部腫脹的大鼠即為類風(fēng)濕(CIA)模型成功大鼠。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)觀察小鼠扭體次數(shù)，計(jì)算扭體次數(shù)?？寡讓?shí)驗(yàn)稱量小鼠左右耳重量，計(jì)算重量差。類風(fēng)濕實(shí)驗(yàn)，分別在治療15 d和35 d測(cè)量大鼠的足腫脹體積，治療35 d后，禁食不禁水8 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.7 mL/100 g)，麻醉后，取脾臟、胸腺稱重，稱重后的脾臟進(jìn)行固定，將固定后的脾臟HE染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠扭體次數(shù)、耳腫脹重量差值比較

由表1可見(jiàn)，與空白組比較，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽(yáng)性對(duì)照藥組都對(duì)小鼠的扭體次數(shù)有顯著的抑制作用(P<0.01)。與空白組比較，蜂針蜇刺5 min、1 min、陽(yáng)性對(duì)照藥組都對(duì)小鼠耳腫脹重量差值有抑制作用(P<0.05)。

表1 小鼠扭體次數(shù)、耳腫脹重量差值的比較

2.2 各組大鼠的足腫脹體積、足厚度、足周長(zhǎng)比較

由表2可見(jiàn)，與模型組比較，在造模前1天，各治療組和空白組的都沒(méi)有差異；與模型組比較，在治療15 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min足腫脹體積有減小(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照藥組有顯著減小(P<0.01)；與模型組比較，在治療35 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽(yáng)性對(duì)照藥組都有顯著減小(P<0.01)。

表2 各組大鼠的足體積比較

由表3可見(jiàn)，與模型組比較，在造模前一天，各治療組和空白組的足厚度都沒(méi)有差異；與模型組比較，在治療15 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s 、陽(yáng)性對(duì)照藥組的足厚度都有顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，在治療35 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽(yáng)性對(duì)照藥組的足厚度都有顯著增高(P<0.01)。

表3 各組大鼠的足厚度比較

由表4可見(jiàn)，與模型組比較，在造模前1天，各治療組和空白組的足周長(zhǎng)都沒(méi)有差異；與模型組比較，在治療15 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽(yáng)性對(duì)照藥組的足周長(zhǎng)都有顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，在治療35 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽(yáng)性對(duì)照藥組的足周長(zhǎng)都有顯著增加(P<0.01)。

表4 各組大鼠的足周長(zhǎng)比較

2.3 各組大鼠的脾臟重量、胸腺重量比較

由表5可見(jiàn)，與模型組比較，蜂針蜇刺5 min、1 min脾臟重量有減小(P<0.05)，蜂針蜇刺30 s、陽(yáng)性對(duì)照藥組有顯著減小(P<0.01)；與模型組比較，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽(yáng)性對(duì)照藥組胸腺重量都有顯著減小(P<0.01)。

表5 CIA模型脾臟、胸腺重量的比較

2.4 各組大鼠脾組織形態(tài)比較

由圖1可見(jiàn)，脾組織形態(tài)比較可見(jiàn)，空白組淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)清晰，胞核胞漿界限分明。模型組淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)基本破壞，伴隨著大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)大量的出血點(diǎn)，部分細(xì)胞核溶解或破碎，淋巴細(xì)胞輕度增生，體積變大，白髓和紅髓界限不清晰。陽(yáng)性對(duì)照藥組淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)正常，胞核大小均一，排列整齊。蜂針蜇刺5 min組出血點(diǎn)明顯減少，淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，紅髓結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。蜂針蜇刺1 min組淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，但不夠完整，局部區(qū)域出血點(diǎn)較多。蜂針蜇刺30 s組部分淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，但部分淋巴細(xì)胞仍有增生現(xiàn)象。

3 討論

本研究表明，蜂針治療在鎮(zhèn)痛和抗炎作用上有明顯的意義，在類風(fēng)濕模型大鼠上也有明顯的改善腫脹關(guān)節(jié)的作用和調(diào)節(jié)免疫的作用，同時(shí)還可以影響病變的骨組織。

蜂療主要是通過(guò)蜜蜂蜂針將蜜蜂體內(nèi)的活性物質(zhì)帶入人體內(nèi)，現(xiàn)在研究表明，蜜蜂毒囊中主要成分是蜂毒，蜂毒是存在于蜜蜂毒囊中由毒腺分泌的無(wú)色芳香液體，其化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括活性酶類(透明質(zhì)酸酶、磷酸酯酶A2)、多肽類(蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大細(xì)胞脫粒肽、鎮(zhèn)靜肽等)、糖類、脂類、氨基酸類和胺類物質(zhì)等[6-7]。目前，蜂針?lè)涠驹谂R床中有著非常廣泛的應(yīng)用，涉及運(yùn)動(dòng)、呼吸、循環(huán)、神經(jīng)、消化、內(nèi)分泌、泌尿、生殖等各大系統(tǒng)，包括疼痛、炎癥、腫瘤、自身免疫病等多種疾病[8-14]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽是人類目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗炎物質(zhì)之一，其抗炎強(qiáng)度是氫化可的松的100倍，具有類激素樣的作用，但卻沒(méi)有其副作用[7]。蜂毒肽可以刺激機(jī)體分泌皮質(zhì)激素，阻止局部炎癥的發(fā)生[1]。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)紅腫熱痛、晨僵、胃納不佳的慢性系統(tǒng)性疾病。疾病晚期會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形, 活動(dòng)受限, 甚至導(dǎo)致肢體永久性殘疾。其病因未明，考慮可能與遺傳、感染、性激素等有關(guān)。其治療目前主要分為西醫(yī)和中醫(yī)兩方面, 西醫(yī)通常是采用抗炎鎮(zhèn)痛、免疫抑制等方法, 其優(yōu)勢(shì)是可以暫時(shí)控制住病情的發(fā)展, 但存在具有較大的毒副作用等缺點(diǎn)。而中醫(yī)方面主要是中藥內(nèi)服、外敷、針灸、穴位注射等。隨著中醫(yī)治療的發(fā)展，其治療效果有很大的進(jìn)步，同時(shí)可以有效地減少不良反應(yīng)的發(fā)生。其中近期臨床研究發(fā)現(xiàn)，蜂針蜇刺治療在臨床上有很大的應(yīng)用空間，不但可以取得良好的治療效果，也可以減少毒副作用帶來(lái)的痛苦[9，15-18]。

圖1 蜂針蜇刺對(duì)CIA大鼠脾臟組織的影像(HE，×100)

本研究的目的就是在實(shí)驗(yàn)層面上驗(yàn)證蜂針蜇刺的效果，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜂針蜇刺治療可以有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用，同時(shí)對(duì)類風(fēng)濕模型大鼠的足腫脹、足周長(zhǎng)、足厚度、脾臟重量、胸腺重量、脾臟組織病理結(jié)構(gòu)有明顯改變，提示蜂針蜇刺治療有可能在炎癥抑制上有很好的作用效果，但仍需要更進(jìn)一步的機(jī)制研究來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。綜上所述，蜂針蜇刺治療可以有效改善類風(fēng)濕模型大鼠的疾病情況，為以后在機(jī)制層面更好的進(jìn)行研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。