王昊陽 孟維艷

隨著種植手術成功率的提升及植入技術的改進，越來越多的患者選擇種植義齒來替代缺失的牙齒[1]。醫(yī)用級鈦(Ti)及其合金具有良好的生物相容性、耐腐蝕性和低免疫原性等優(yōu)勢，是目前最為常見的口腔植入物材料。但由于純鈦表面具有生物惰性且不具備抗菌活性，細菌可與成骨細胞及其他細胞競爭粘附于鈦植入物表面形成初始定植，最終形成成熟的生物膜。這種潛在致病菌的粘附、增殖與種植體周圍的炎癥變化直接相關，進而嚴重影響骨整合導致種植義齒修復失敗[2,3]。隨著納米醫(yī)學的興起，通過納米改性形成的植入物表面被賦予優(yōu)異的抗菌能力。作為一種獨特的納米結構，TiO2納米管可通過陽極氧化等方法制備而成[4]。有文獻證實，TiO2納米管促進成骨細胞的黏附和增殖，并表現(xiàn)出減少表皮葡萄球菌的初始粘附與定植的能力。與光滑鈦表面相比，TiO2納米管在具備抗菌能力的同時增強了成骨活性，從而提升植入物成功率[5]。此外，TiO2納米管還可作為抗菌劑載體發(fā)揮抗菌作用。綜上，具備抗菌作用的TiO2納米管在治療種植體周圍炎方面有巨大潛力。然而，目前尚缺乏TiO2納米管抗菌機制的具體總結。本綜述旨在探索TiO2納米管表面結構對細菌粘附增殖的影響，總結TiO2納米管作為抗菌劑載體的研究現(xiàn)狀并對TiO2納米管在口腔種植抗菌領域的應用進行展望。

1.單純TiO2納米管的抗菌能力

從細菌粘附到植入物表面至最終成熟形成生物膜的過程通常分為兩個階段。第一階段中，細菌與植入物表面快速相互作用形成可逆性附著，此時粘附的細菌容易脫落。第二階段，細菌表面結構與植入物表面發(fā)生特異性與非特異性相互作用并產生強烈的附著力，這一階段是緩慢且不可逆的。隨后定植的細菌分泌細胞外基質，最終形成生物膜。一旦形成成熟的生物膜，抗生素的治療將變得十分困難[6]。單純TiO2納米管的抗菌特性主要包括抑制細菌初始粘附以及殺滅細菌兩方面。

1.1 單純TiO2納米管對細菌粘附的抑制作用目前，關于細菌與納米結構相互作用的研究已經取得巨大突破，影響細菌粘附定植的因素包括材料的剛度、疏水性、表面粗糙度、表面電荷以及細菌的細胞膜結構、剛度等，但目前調控細菌與納米結構相互作用的準確機制尚未得知[7]。Valdez-Salas 等[8]證明TiO2納米管可減少革蘭氏陰、陽性菌的初始粘附。同時作者還發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌(革蘭氏陰性菌)相比于表皮葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)發(fā)生更多的形態(tài)改變，其原因可能是相比于革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌肽聚糖層較薄，流體雙層膜更多，在細菌遷徙運動時更易于與納米結構錨定從而發(fā)生形變。TiO2納米管的親水性及粗糙度亦是影響細菌初始粘附的重要因素。目前較公認的說法為材料親水性與細菌粘附的關系與細菌種類息息相關，實驗證明，疏水性的細菌如表皮葡萄球菌及金黃色葡萄球菌更易粘附于疏水性的表面，并且材料表面的疏水性是細菌的粘附的主要驅動力，相反親水性的細菌易于粘附于親水性表面[9,10]。但影響植入物表面細菌定植是由細菌與宿主細胞共同決定的，并非細菌單方面因素。根據(jù)“表面競爭”理論，宿主細胞及細菌會對植入物表面產生競爭性粘附，若宿主細胞的早期定植并先于細菌充滿覆蓋植入物表面可以免受細菌的影響，可大大減少植入物術后感染的風險，相反若細菌贏得競爭，植入表面最終會被生物膜覆蓋，導致感染[11]。Peng 等[5]建造了親水性的TiO2納米管表面，親水的表面促進了成骨細胞黏著斑的形成進一步加速成骨細胞的早期粘附，隨后擴散、增殖分化，同時減少表皮葡萄球菌的附著。此外，親水性的TiO2納米管表面還可促進纖連蛋白的粘附，隨后通過與細胞表面受體相互作用加速了成骨細胞的定植，改善早期成骨的能力[12,13]。雖然關于細菌與宿主細胞的“表面競爭”理論尚不成熟且缺乏細菌與細胞間相互作用的長期觀察，而且材料表面親水性并非影響細菌粘附的唯一因素。但通過建造親水性材料表面加速成骨細胞的早期定植同時抑制細菌的定植以減少細菌感染導致的種植失敗具有重要的臨床指導意義。另一方面，目前關于TiO2納米管表面粗糙度對細菌粘附性影響的說法尚未統(tǒng)一，因為伴隨著粗糙度的變化會導致材料表面親水性及空間形貌發(fā)生改變。但大多數(shù)研究表明細表面粗糙度越大的TiO2納米管親水性越好，越不利于細菌的粘附[5,14]。

1.2 單純TiO2納米管的殺菌作用 在之前的研究中，Ercan 等[15]證明TiO2納米管的管徑形態(tài)可以引起細菌應激反應導致其細胞膜的破壞從而產生殺菌作用。并且研究結果顯示隨著TiO2納米管直徑的增加，抗菌效果得到增強，其中直徑為80nm的TiO2納米管抗菌效果最佳。Peng 等[5]也得出了類似的結論，相比于直徑較小(30nm)的TiO2納米管大尺寸(80nm)的TiO2納米管可更有效的限制表皮葡萄球菌的增殖。然而，關于納米管尺寸參數(shù)對其抗菌性能的討論尚未達成一致。Narendrakumar等[16]得到了不同的結論，作者提出直徑為15nm 的TiO2納米管對血鏈球菌和變形鏈球菌的抗菌效果更優(yōu)異。Kummer 等[17]的研究表明，小尺寸納米管(20nm)相比于大直徑納米管(80nm)表現(xiàn)出更好的抗菌效果。造成這些差異化的結果可能原因是陽極氧化法的制備條件難以保證一致，電壓、電解質溶液等參數(shù)的變化及TiO2納米管的晶型不同均會對TiO2納米管的形態(tài)及抗菌特性產生影響[18]。

TiO2納米管的抗菌機制比較復雜，納米管的尺寸、表面粗糙度、表面濕潤性等均為影響其抗菌效果的重要因素。盡管關于這些因素對TiO2納米管抗菌性能影響的說法尚未統(tǒng)一，但TiO2納米管已經展現(xiàn)出其優(yōu)異的抗菌效果，且納米管的制備方法簡單且較為可控，是一種有前景的抗感染植入物材料。

2.TiO2納米管的光催化殺菌作用

TiO2是一種有前途的光催化劑，在紫外光的催化作用下可產生活性氧類物質(ROS)，在氧化應激作用下破壞細菌的細胞膜以達到抗菌效果[19]。隨著納米醫(yī)學的發(fā)展，TiO2納米管的晶型、尺寸、形貌在加工過程中均可控，使其在光催化消毒領域展現(xiàn)出良好的應用前景。實驗證明，在紫外光照射24h下，TiO2納米管抗大腸桿菌及金黃色葡萄球菌活性高達97.53%和99.94%[20]。Liu 等[21]通過水熱合成法將TiO2納米顆粒均勻涂覆在TiO2納米管內，相比于單純TiO2納米管，復合物光催化位點更多，在紫外光照射下產生大量ROS。高濃度的ROS 破壞細胞膜，從而殺滅表皮葡萄球菌與牙齦卟啉單胞菌并抑制了生物膜形成。由于紫外照射可能會對實驗者產生傷害，目前研究者們致力于在可見光條件下改善TiO2納米管的抗菌性能。Moon 等[22]通過離子濺射法將Au 與Pt 納米粒子沉積在TiO2納米管納米管表面，在波長600nm 的可見光催化作用下具有殺滅金黃色葡萄球菌的作用，并且具有良好的生物相容性，提高了骨髓間充質細胞成骨相關基因的表達。

3.TiO2納米管作為抗菌劑載體

TiO2納米管由于具有開口的頂端以及封閉的底部的獨特結構，已被廣泛用作遞送抗菌劑的載體平臺。而且，作為一種局部遞送藥物載體，可大大降低全身給藥的成本及產生耐藥性的風險。但目前物理吸附法及凍干法等藥物裝載方式難以達到理想的藥物釋放效果。為改善藥物突釋帶來的不利影響，研究者們通過改變納米管的尺寸[23]、使用聚合物多層膜對納米管表面進行包封[24]等方法，延緩抗菌劑的釋放，獲得長期抗感染的效果。目前，較為常見的摻入TiO2納米管的抗菌劑如下。

3.1 抗生素 抗生素類藥物如萬古霉素、米諾環(huán)素、頭孢菌素等作為抗菌劑的研究長達數(shù)十年。Riahi 等[23]延長陽極氧化時間增加了TiO2納米管長度，隨后再通過電泳沉積法將大量的萬古霉素沉在TiO2納米管底部，其載藥量為物理吸附法的6 倍，并且使第一小時內的藥物突釋量從84%降至23%，顯著延長了萬古霉素的釋放時間。Fathi 等[25]通過陽極氧化法制造了直徑約為110nm，長度為40nm TiO2納米管以最大程度負載萬古霉素，隨后通過靜電紡絲技術將納米絲素蛋白纖維涂覆在TiO2納米管表面，使金黃色葡萄球菌的粘附減少，且萬古霉素釋放時間延長至30 天。作為臨床上使用最多的抗感染藥物，抗生素的作用機理在這里不做過多闡述，而且其導致的細菌多藥耐藥性問題仍難以解決，應致力于尋找新型非抗生素類抗菌劑。

3.2 金屬納米粒子 金屬納米粒子包括直徑小于100nm 的金屬及金屬氧化物納米顆粒，許多金屬自身便具備一定的抗菌能力，當他們的尺寸達到納米級別時，他們的抗菌特性會得到增強[26]。作為目前研究最多的抗菌劑，銀納米粒子的抗菌機理包括破壞細菌的細胞膜的完整性，使細胞內容物泄露而殺死細菌。此外，銀納米粒子還可促進氧化應激反應，從而產生過量的活性氧，干擾細菌DNA 的合成[27]。但同樣Ag 納米粒子可以通過胞吞、胞吐作用在真核細胞中被累計，誘導氧化應激并對真核細胞的DNA 復制產生影響。但可能由于相比于真核細胞細菌的結構相對簡單，核膜的缺乏使環(huán)狀DNA雙鏈直接暴露于胞質內的銀納米顆粒中，導致細菌對氧化應激反應更敏感[28]。但是，高濃度銀離子的細胞毒性問題仍不可忽視。為獲得銀離子持續(xù)穩(wěn)定釋放且減輕細胞毒性的效果，Guan 等[29]將銀納米粒子通過聚多巴胺涂覆在TiO2納米管表面，與純鈦對照組相比，銀納米粒子抑制了金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的生長。同時聚多巴胺使銀釋放更加平緩，降低銀納米粒子的細胞毒性作用。Yuan 等[24]在TiO2納米管底物上覆蓋了自組裝殼聚糖/ 海藻酸二醛多層膜并將銀納米顆粒封裝在納米管陣列中，結果顯示多層膜抑制了細菌的粘附并延緩了銀離子的釋放。除預期的抗菌效果以外，多層膜展示出對成骨細胞的親和力，促進了成骨細胞的粘附增殖。

從臨床安全性角度考慮，銀并非是人體內所含的必要元素。因此，更應選擇利于排泄且人體營養(yǎng)所需的元素，例如：鋅。納米氧化鋅的抗菌機理與納米銀的抗菌機理類似，包括：破壞細菌的細胞膜、金屬離子釋放、產生活性氧及空間效應等[30]。Liu 等[31]通過水熱法制備了不同鋅離子濃度的含鋅TiO2納米管，其抗菌效果均優(yōu)于單純的TiO2納米管，其中0.015M 濃度的鋅離子可以最好的殺滅牙齦卟啉單胞菌并下調變形鏈球菌粘附相關基因及毒力基因gtfB、gtfC、gtfD 的表達，并且未對干細胞生物相容性產生影響。已有相關實驗將ZnO 納米顆粒與其他種類金屬納米顆粒共同摻入TiO2納米管中，例如ZnO/ Sr 等，可以表現(xiàn)出兼具成骨抗菌的雙功能效果[32]。雖然目前存在制備過程較為繁瑣且不同種金屬納米顆粒在納米管內分布不均的問題，但這為以后制造多功能鈦植入物提供新思路。

3.3 抗菌肽 抗菌肽是一系列具有抗菌活性及免疫調節(jié)能力的短肽序列的總稱，具有廣譜的抗菌活性、低毒性及低耐藥性等優(yōu)點。Li 等[33]使用賴氨酸殘基替換人腮腺分泌蛋白的部分氨基酸序列合成了新型抗菌肽GL13K，隨后通過浸泡法將其存儲在TiO2納米管內。合成的陽離子抗菌肽GL13K可與牙齦卟啉單胞菌帶負電荷的細胞膜相互作用破壞其屏障功能進而影響細菌活性，而未經修飾的TiO2納米管抗牙齦卟啉單胞菌效果較差。但由于物理吸附法的限制，抗菌肽在前30 分鐘內存在突釋行為。Zhang 等[34]對TiO2納米管基體進行了改造，通過控制陽極氧化過程的電壓形成了孔徑不同的雙層納米管。底部為大孔徑(140nm)的藥物儲存層，上部為小孔徑(35nm 或70nm)“納米帽”以控制藥物的釋放。雙層鈦納米管可控制抗菌肽ponericin G1長期釋放高達60 天。除抗菌肽對細菌的殺傷作用以外，頂部小孔徑的“納米帽”還可抵抗細菌的初始粘附，這對長期抗感染有重要意義。作為替代抗生素的新型抗菌劑，抗菌肽的殺菌作用已被廣泛研究，但隨著抗菌肽的大量使用，多種抗菌肽靶向作用單一蛋白為基因突變及細菌產生耐藥性提供了可能。細菌可通過胞外多糖避免抗菌肽與細菌細胞膜的直接接觸，還可以分泌蛋白酶降解抗菌肽以及與宿主防御肽的交叉抗性等方法對抗菌肽產生耐藥性[35]。故應進一步探究細菌對抗菌肽的耐藥的具體機制以便合成新型抗菌肽。

4.總結

目前針對TiO2納米管的抗菌特性已經做了大量研究。雖然這種具備高比表面積、排列緊密的納米管狀結構已展示出良好的抗菌作用，且聯(lián)合抗菌劑的應用已顯示令人信服的抗感染作用。然而，關于TiO2納米管研究仍然需要更深入的研究以探索TiO2納米管最佳抗菌尺寸，以尋求兼具生物相容性及優(yōu)異抗菌能力的表面形貌。且作為抗菌劑載體，藥物難以控制突釋行為以及細菌耐藥性仍亟待解決。未來可通過合理摻雜不同種類抗菌劑協(xié)同增強TiO2納米管的抗菌效果同時降低細菌耐藥性的風險。TiO2納米管的光動力治療將會是一個很好的研究領域，在安全的可見光催化下，通過與金屬納米顆粒的結合可獲得長期有效的抗菌效果，并降低了患者的經濟負擔。目前關于可見光催化TiO2納米管活性的研究尚淺，未來應進行更多的動物實驗進行體內研究。