王洋洋 鄭怡 劉晶 邢津驍 湯繼芹

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)院 濰坊 261053；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院 濟(jì)南 250355)

耳聾已成為最常見(jiàn)的一種內(nèi)耳感覺(jué)障礙性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2019年數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)近1/3的65歲以上老人及每500個(gè)新生兒就有1個(gè)患有不同程度的聽(tīng)力損失[1]。耳聾不但會(huì)造成嚴(yán)重的溝通障礙，有研究[2]表明，聽(tīng)力喪失可能是阿爾茨海默病認(rèn)知障礙的危險(xiǎn)因素之一。耳聾可分為感音神經(jīng)性耳聾、傳導(dǎo)性耳聾和混合型耳聾，臨床最常見(jiàn)的是感音神經(jīng)性耳聾[3]。感音神經(jīng)性耳聾主要是由感覺(jué)毛細(xì)胞大量損傷或者死亡，且無(wú)法再生引起的。所以闡述耳蝸毛細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程、損傷原因及再生途徑，對(duì)于臨床預(yù)防、診斷和治療感音神經(jīng)性耳聾均有很大幫助。在毛細(xì)胞形成過(guò)程中，Notch信號(hào)通路起到了調(diào)控作用。γ-分泌酶抑制劑、Math1和microRNA等可以影響Notch信號(hào)通路間接作用于毛細(xì)胞的修復(fù)，這為毛細(xì)胞原位再生提供了依據(jù)，也為根治感音神經(jīng)性耳聾提供了新的策略和方向。

1 毛細(xì)胞

毛細(xì)胞和支持細(xì)胞是存在于哺乳動(dòng)物內(nèi)耳感覺(jué)上皮最主要的2種細(xì)胞。當(dāng)聲音傳入耳中引起基底膜振動(dòng)，毛細(xì)胞將這種機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，通過(guò)聽(tīng)神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)傳至聽(tīng)覺(jué)中樞，產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)[4]。但是由于毛細(xì)胞易因耳毒性藥物的使用、遺傳、內(nèi)耳微循環(huán)障礙、病毒感染、噪聲暴露及年齡等因素?fù)p傷或者死亡，且無(wú)法再生，這將導(dǎo)致永久性感音神經(jīng)性耳聾[5-6]。臨床上改善聽(tīng)力的方法主要是藥物治療、使用人工耳蝸等輔助裝置或手術(shù)[7]，但無(wú)法根治耳聾。

2 Notch信號(hào)通路

Notch基因首次在翅膀邊緣殘缺的果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[8]，引得大量醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的學(xué)者對(duì)其進(jìn)行深入研究。目前已證明，Notch信號(hào)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、各種惡性腫瘤、骨發(fā)育疾病及血液系統(tǒng)性疾病均有巨大關(guān)聯(lián)[9-12]。

Notch信號(hào)高度保守，是一條短距離信號(hào)通路，廣泛存在于自然界的生物中，可參與細(xì)胞增殖、分化等多項(xiàng)生命活動(dòng)，并維持內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡[13]。該通路主要由 Notch膜蛋白受體(分為Notch1-4)、Notch配體即DSL蛋白、CSL轉(zhuǎn)錄因子、下游效應(yīng)物等組成[14]。有研究[15]表明，Notch信號(hào)通路可調(diào)控毛細(xì)胞分化，利用Notch信號(hào)通路治療耳聾成為臨床診治聽(tīng)力障礙的一個(gè)新導(dǎo)向。再加上當(dāng)今生物技術(shù)的不斷發(fā)展，分子治療越來(lái)越廣泛，進(jìn)一步促進(jìn)人們研究應(yīng)用Notch信號(hào)改善聽(tīng)力，根治耳聾[16]。

3 Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑與毛細(xì)胞再生

3.1 Notch信號(hào)在毛細(xì)胞發(fā)育、再生中的作用 內(nèi)耳發(fā)育成熟的過(guò)程中離不開(kāi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同調(diào)節(jié)，目前比較公認(rèn)的通路有Notch信號(hào)通路、FGF信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等[17]。其中，Notch信號(hào)在內(nèi)耳發(fā)育前期負(fù)責(zé)內(nèi)耳感覺(jué)前體細(xì)胞的增殖，后期通過(guò)旁側(cè)抑制決定毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的命運(yùn)，Notch信號(hào)途徑被抑制的細(xì)胞分化為毛細(xì)胞，其周圍細(xì)胞分化為支持細(xì)胞形成嵌合體[18-19]。

過(guò)去幾年研究表明，非哺乳動(dòng)物聽(tīng)力損傷后可將支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化成新的毛細(xì)胞進(jìn)而恢復(fù)聽(tīng)力[20]，但是成熟的哺乳動(dòng)物中內(nèi)耳毛細(xì)胞一旦受損便不可再生，聽(tīng)覺(jué)永久性喪失[21]?，F(xiàn)已表明：新生小鼠的支持細(xì)胞具有轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞的潛力，可通過(guò)阻斷Notch信號(hào)在毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)[22-23]。因此，抑制Notch信號(hào)促進(jìn)再生耳蝸毛細(xì)胞是治療感音神經(jīng)性耳聾的新策略之一[24]。

3.2 Notch信號(hào)通路途徑的激活 Notch信號(hào)途徑?jīng)]有第二信使的參與，不具備信息放大效應(yīng)。相鄰細(xì)胞進(jìn)行信息傳導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)Notch受體接受信號(hào)后釋放胞內(nèi)域部分(notch intracellular domain ,NICD，Notch的活化形式)，就此Notch信號(hào)通路開(kāi)始激活并發(fā)揮作用。

在哺乳動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)感受上皮細(xì)胞中，Notch1是主要受體，與之結(jié)合的主要是DELl、JAG1和JAG2等配體[18]。分化成功的毛細(xì)胞表達(dá)Math1和配體Delta1和Jagged2，Notch信號(hào)依賴于細(xì)胞表面的Notch受體與鄰近細(xì)胞的DSL配體結(jié)合而激活，隨后跨膜區(qū)S3位點(diǎn)的肽鍵被γ-分泌酶水解，釋放NICD，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中。CSL家族(CBF1、SuH、Lag1)轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合后，變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活因子，與其他激活物共同促進(jìn)染色體重建，表達(dá)E(spl)/Hes等下游靶基因，產(chǎn)生bHLH轉(zhuǎn)錄因子如Hes1和Hes5，具有抑制效應(yīng)。后兩者均與對(duì)應(yīng)的分化效應(yīng)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制分化基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制毛細(xì)胞生成[17]。

3.3 Notch信號(hào)的影響因素與內(nèi)耳感覺(jué)上皮的再生

1)Notch信號(hào)通路可被γ-分泌酶抑制劑(DAPT)抑制，促進(jìn)毛細(xì)胞再生。γ-分泌酶在Notch信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中意義巨大，主要負(fù)責(zé)水解分割Notch受體，因此γ-分泌酶抑制劑可顯著抑制該通道的酶切過(guò)程。

之前認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物的支持細(xì)胞已經(jīng)失去了自發(fā)繁殖與轉(zhuǎn)化毛細(xì)胞的能力,但是新的研究表明，在抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)后，支持細(xì)胞仍具有轉(zhuǎn)變?yōu)槊?xì)胞的潛力[25]。目前，Ni等[26]、Mizutari等[27]在培養(yǎng)的胚胎或者新生兒耳蝸加入γ-分泌酶抑制劑抑制Notch信號(hào)，在原位發(fā)現(xiàn)了多余的毛細(xì)胞，并證明再生毛細(xì)胞主要是由支持細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化得來(lái)。Li等[28]利用電子顯微鏡和細(xì)胞電生理技術(shù)檢查P0沙土鼠Corti器再生毛細(xì)胞的靜纖毛、機(jī)械傳導(dǎo)、基底外膜和電生理特性，結(jié)果證明小鼠出生后抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)可以將支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞，且新生毛細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械刺激發(fā)揮作用。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)用相同的DAPT處理方式分別培養(yǎng)P0沙鼠和P5沙鼠的Corti器模型，檢查靜纖毛束和Myo7a陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)后者頂端轉(zhuǎn)角2個(gè)指標(biāo)的增加不如P0沙鼠制備的培養(yǎng)物中明顯。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了Liu等[29]提出的Notch抑制的年齡依賴性。

2) 抑制Notch信號(hào)促進(jìn)Math1過(guò)表達(dá)有利于毛細(xì)胞再生。Math1是一種螺旋環(huán)轉(zhuǎn)錄因子(bHLH)，在內(nèi)耳上皮感覺(jué)毛細(xì)胞發(fā)育和損傷后再生具有關(guān)鍵作用。Math1首先在E12.5期的胚胎耳蝸基底耳蝸轉(zhuǎn)角的前體細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，隨后E14.5時(shí)在耳蝸基底部激增，并逐漸向耳蝸?lái)敳繑U(kuò)展，在E17.5時(shí)整個(gè)Corti器發(fā)育結(jié)束[30]。然后Math1的產(chǎn)生逐漸下降，直到出生后第6天幾乎降為零，無(wú)法檢測(cè)到[31]。目前認(rèn)為毛細(xì)胞只有在Math1表達(dá)時(shí)才能夠發(fā)育，成熟哺乳動(dòng)物已經(jīng)不再表達(dá)Math1，這可能會(huì)造成內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷后無(wú)法再生[32]。Luo等[33]研究證明Math1過(guò)度表達(dá)可在上皮嵴誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生。

細(xì)胞的Notch信號(hào)激活后，下游靶基因Hes1、Hes5表達(dá)與Math1基因啟動(dòng)子結(jié)合，使Math1無(wú)法轉(zhuǎn)錄表達(dá)，所以該細(xì)胞無(wú)法向毛細(xì)胞方向發(fā)展，最終成為支持細(xì)胞[34]。因此抑制Notch信號(hào)可以通過(guò)促進(jìn)Math1表達(dá)的方式，影響毛細(xì)胞再生。Luo等[35]在實(shí)驗(yàn)中使用新霉素破壞原始耳蝸毛細(xì)胞后，添加DAPT和Ad5-GFP-Atoh1感染組合時(shí)比沒(méi)有DAPT處理的耳存在更多的GFP/肌球蛋白7A雙免疫反應(yīng)細(xì)胞，證明抑制Notch可以顯著增強(qiáng)Math1的活性，并將支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞，從而大大提高新毛細(xì)胞形成的效率，在原位產(chǎn)生更多的毛細(xì)胞。

3) microRNA可作為調(diào)控Notch信號(hào)的新靶點(diǎn)。microRNA是一種非編碼的、內(nèi)源性小分子單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后可抑制相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)組織分化、器官形成和新陳代謝等過(guò)程[36]。目前認(rèn)為microRNA可能在內(nèi)耳發(fā)育和功能中起重要作用。有研究[37-38]表明，在感覺(jué)上皮分化期間，miR-183主要在毛細(xì)胞中表達(dá)，而Notch1和Hes1主要在支持細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)內(nèi)耳發(fā)育期間miR-183和Notch1的空間獨(dú)占表達(dá)模式表明miR-183和Notch信號(hào)傳導(dǎo)之間可能存在潛在關(guān)聯(lián)。另外，陳智斌等[39]利用拓?fù)鋵W(xué)分析等方法篩選出能夠顯著調(diào)控Notch信號(hào)途徑的microRNA分子，主要以microRNA-384-5p為研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示microRNA-384-5p在小鼠耳蝸中具有特異性表達(dá)，在其轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，Notch1的表達(dá)水平明顯下降。該實(shí)驗(yàn)證明，miR-384-5p分子可靶向調(diào)控Notch信號(hào)通路，可作為毛細(xì)胞再生的干預(yù)靶點(diǎn)。

4) 表觀遺傳修飾影響成年毛細(xì)胞再生。Samarajeewa等[40]指出，表觀遺傳修飾是成人毛細(xì)胞再生能力受限的潛在原因之一。表觀遺傳修飾在不改變基因核苷酸序列的基礎(chǔ)上，可動(dòng)態(tài)、可逆修改細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。除抑制Notch信號(hào)外，利用表觀遺傳酶如HATs、HDACs和DNMTs可能會(huì)提高成體階段的再生成功率。事實(shí)上，一些針對(duì)DNMTs和HDACs的小分子抑制劑已被批準(zhǔn)使用，可能會(huì)用于哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

Notch信號(hào)通路抑制耳蝸毛細(xì)胞的分化，利用DAPT可以通過(guò)抑制Notch信號(hào)和上調(diào)Math1的表達(dá)兩方面來(lái)促進(jìn)成熟哺乳動(dòng)物的支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞。另外，microRNA可作為Notch信號(hào)調(diào)控的靶基因，進(jìn)一步改善聽(tīng)力。雖然我們對(duì)于Notch信號(hào)通路及其影響有了大致的了解，但是仍然需要繼續(xù)深入研究Notch信號(hào)通路的作用機(jī)制及應(yīng)用方式。目前大多數(shù)數(shù)據(jù)是在制作的動(dòng)物耳蝸模型中得到，離應(yīng)用于人體還有很長(zhǎng)的距離，敲除Notch信號(hào)途徑中的某基因或者使用影響Notch信號(hào)通路的藥物來(lái)治療耳聾是否具有副作用都需要進(jìn)一步探討。因此，如何利用一些關(guān)鍵點(diǎn)更精確地調(diào)控Notch信號(hào)以誘導(dǎo)存活率高、功能正常的毛細(xì)胞是將來(lái)重要的研究方向。此外應(yīng)進(jìn)一步將研究?jī)?nèi)耳毛細(xì)胞再生的實(shí)驗(yàn)建立在動(dòng)物活體模型基礎(chǔ)上，確立靶向調(diào)控Notch信號(hào)的關(guān)鍵點(diǎn)在修復(fù)內(nèi)耳毛細(xì)胞的同時(shí)是否還具有其他副作用，以期早日根治感音神經(jīng)性耳聾。