VTRNA2-1在特應(yīng)性皮炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)分析

萬夢婕， 王 薇， 范秀紅

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院暨?？谑腥嗣襻t(yī)院皮膚性病科, 海南 海口 570208)

特應(yīng)性皮炎(Atopic Dermatitis，AD)主要以皮膚干燥、瘙癢、炎癥等為特征，是一種慢性且易復(fù)發(fā)的皮膚性疾病[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，全球AD患病率成人達(dá)2%～5%[2,3]。AD因病程較長和反復(fù)發(fā)作性嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，同時(shí)對家庭及社會(huì)構(gòu)成巨大負(fù)擔(dān)。目前對于AD發(fā)病機(jī)制研究較為復(fù)雜，涉及上皮屏障功能障礙、免疫系統(tǒng)過度活化、皮膚微生物群失調(diào)等方面[4]。早期研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞的免疫失衡在AD發(fā)病過程中扮演著關(guān)鍵的角色，而長的非編碼RNA(lncRNA)作為功能性大分子可充當(dāng)T淋巴細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)劑[5]。穹窿核糖核酸2-1(vault ribonucleic acid 2-1，VTRNA2-1)是一種穹頂RNA，最初被分類為microRNA前體hsa-mir-886，又稱為“Nc886”，是一種新型的lncRNA[6]。VTRNA2-1被認(rèn)為是先天免疫反應(yīng)中活化蛋白激酶R(protein kinaseR，PKR)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，且發(fā)現(xiàn)VTRNA2-1的表達(dá)在人類CD4+激活過程中高度上調(diào)T細(xì)胞[7]。但目前在皮膚疾病中描述VTRNA2-1與 PKR的作用研究報(bào)道較少，因此，本研究探討VTRNA2-1在AD患者中的基因表達(dá)水平，分析其與PKR存在的相互作用關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象：收集2018年1月至2020年5月期間在本院皮膚科的AD患者50例為AD組，同期內(nèi)另選取體檢科行健康體檢者30例設(shè)為對照組。AD組男28例，女22例，年齡22～53歲，平均(35.25±9.25)歲；對照組男14例，女16例，年齡24～55歲，平均(35.72±9.07)歲，兩組性別及年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.655/t=0.222，P均>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①AD患者符合《中國特應(yīng)性皮炎診療指南(2020版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②年齡≥18歲；③患者及家屬均在知情且同意參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他類型皮膚疾?。虎谌虢M前一個(gè)月內(nèi)曾接受過免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物治療史；③惡性腫瘤、伴有心肝腎等器官嚴(yán)重疾病者。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2分組：對于符合標(biāo)準(zhǔn)的AD患者，入院后收集其特應(yīng)性皮炎評分指數(shù)(Scoring Atopic Dermatitis Index，SCORAD)[9]，該評分包括A(皮損面積)、B(皮損嚴(yán)重程度評分)、C(瘙癢程度和影響睡眠程度評分)三部分。計(jì)算公式：SCORAD總分= A/5+7B/2+C，根據(jù)總分評定 AD 的嚴(yán)重程度并進(jìn)行分組：輕度AD組(0～24分，n=25)，中度AD組(25～50分，n=16)，重度AD組(51～103分，n=9)。輕度AD組男15例，女10例，年齡25～53歲，平均(34.51±9.04)歲；中度AD組男10例，女6例，年齡22～50歲，平均(34.07±9.11)歲；重度AD組男3例，女6例，年齡23～50歲，平均(34.74±9.07)歲。三組性別及年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.313/F=0.125，P均>0.05)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)本采集與處理：患者入組后由熟練的護(hù)士采集AD患者和健康體檢患者外周血5mL肝素抗凝，并迅速送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。血樣本在4℃，3000rpm離心15min，收集血清樣本進(jìn)行編號(hào)，分裝于干凈EP管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2外周血單個(gè)核細(xì)胞分離：取全血標(biāo)本稀釋，水平轉(zhuǎn)子800g離心30min，吸取白色單核細(xì)胞層15mL放置離心管中，加入10mL細(xì)胞洗滌液再次250g離心10min，重復(fù)兩次后棄上清，細(xì)胞重懸備用，采用差異貼壁法純化細(xì)胞2～4h。細(xì)胞稀釋液充分混勻后，滴10μL到玻璃計(jì)數(shù)板上使細(xì)胞稀釋10倍后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在無菌條件下通過免疫磁珠方法(130-045-101，Miltenyi Biotec，德國)從外周血單個(gè)核細(xì)胞中陽性選擇純化CD4+T細(xì)胞。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組VTRNA2-1基因表達(dá)：細(xì)胞總RNA的提?。喝D4+T細(xì)胞放置冰上孵育20min，取出后室溫靜置10min，加入200μL氯仿，放入高速低溫離心機(jī)中，12000rpm離心10min，棄上清，保留底部沉淀RNA，溶解獲得總RNA，上機(jī)檢測RNA濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄PCR：參照相關(guān)試劑盒說明書加入試劑，混勻后低速離心20s使其沉淀，獲得RNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA。VTRNA2-1基因引物序列：F：CGACCCCAGTCATAAACTATGA；R：AAGACCCCTCCCAGATAGATA。采用7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(品牌：賽默飛世爾)進(jìn)行擴(kuò)增，-ΔΔCt法計(jì)算VTRNA2-1基因相對表達(dá)率。

1.3.4Western blot檢測CD4+T細(xì)胞VTRNA2-1蛋白表達(dá)：取細(xì)胞懸液進(jìn)行總蛋白質(zhì)的提取，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒(產(chǎn)地：中國/上海；品牌：澤葉生物)操作說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，將配制好的蛋白緩沖液放置于95℃以上水浴加熱10min至蛋白質(zhì)變性后，冷卻離心10min，-80℃保存。根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠試劑盒中的說明書制備凝膠進(jìn)行凝膠電泳和凝膠成像，利用Image Lab軟件分析條帶灰度值，計(jì)算VTRNA2-1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。

1.3.5免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析VTRNA2-1蛋白與其相互作用蛋白：使用試劑盒提取總蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，置-80℃保存，脫硫生物素標(biāo)記體外轉(zhuǎn)錄的VTRNA2-1與素磁珠和鏈霉親結(jié)合，再與正常細(xì)胞質(zhì)蛋白裂解液孵育，裂解細(xì)胞以13000r/min離心15min得到蛋白上清液，后加入洗脫液洗脫去除雜蛋白，通過Western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1AD組與對照組VTRNA2-1基因相對表達(dá)量比較：AD組患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中VTRNA2-1基因表達(dá)水平為1.55±0.19，對照組為0.77±0.32，兩組比較，AD組患者VTRNA2-1表達(dá)呈高水平狀態(tài)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 AD組與對照組VTRNA2-1基因表達(dá)水平比較

2.2不同程度AD患者VTRNA2-1基因相對表達(dá)量比較：輕度AD組患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中VTRNA2-1表達(dá)水平為1.22±0.19，中度AD組為1.55±0.11，重度為1.79±0.12，不同組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同程度AD患者VTRNA2-1基因表達(dá)水平比較

圖3 SCORAD評分與VTRNA2-1基因表達(dá)水平關(guān)系分析

2.3SCORAD評分與VTRNA2-1基因相對表達(dá)量的關(guān)系：Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AD患者SCORAD評分越高，其外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中VTRNA2-1表達(dá)水平也隨之升高，兩者存在明顯的正相關(guān)，見圖3。

2.4VTRNA2-1蛋白水平及其直接作用蛋白：免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞中有蛋白激酶R(protein kinaseR，PKR)蛋白的表達(dá)，此實(shí)驗(yàn)方法得到的PKR蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)與VTRNA2-1特異性結(jié)合。AD組患者CD4+T細(xì)胞中 VTRNA2-1和PKR的蛋白表達(dá)量較對照組高(P<0.05)，見圖4和表1。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測VTRNA2-1和PKR蛋白

表1 AD組與對照組VTRNA2-1和PKR蛋白表達(dá)水平

3 討 論

參與AD病理過程的細(xì)胞種類有很多，其中CD4+T細(xì)胞亞群在介導(dǎo)內(nèi)源性AD中發(fā)揮著更為重要的作用，當(dāng)表皮細(xì)胞破損后分泌胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素，激活固有淋巴細(xì)胞使其分泌Th2型細(xì)胞炎癥因子，從而促使AD引起炎癥反應(yīng)，而這些炎癥因子又會(huì)與肥大細(xì)胞等相互作用，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)[10]。限于AD當(dāng)前治療手段的有限性，有必要進(jìn)一步深入研究AD的發(fā)病機(jī)制，為臨床提供更佳的治療靶點(diǎn)。

本研究首先采用了AD患者與健康的患者形成對照比較，發(fā)現(xiàn)VTRNA2-1基因表達(dá)水平在AD患者中顯著增高，進(jìn)一步將AD患者按照疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，VTRNA2-1基因表達(dá)水平隨著AD嚴(yán)重程度的加重而升高，且后續(xù)研究證實(shí)了SCORAD評分于VTRNA2-1基因表達(dá)水平存在明顯的正相關(guān)，因此初步認(rèn)為VTRNA2-1在活化的分泌細(xì)胞因子的人CD4+T細(xì)胞中高度上調(diào)，其升高可能與AD疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。VTRNA2-1基因的高表達(dá)在許多腫瘤組織中均有表現(xiàn)，其可以通過啟動(dòng)二核苷酸修飾在表觀遺傳上受控制，并且可以發(fā)揮抑癌或致癌功能，且VTRNA2-1啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)及其與臨床相關(guān)參數(shù)存在相關(guān)性[11]。不過在與細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)的T細(xì)胞活化過程中，VTRNA2-1是以依賴于持續(xù)刺激的方式高度上調(diào)。Sallustio等[12]在IgA腎病患者研究中發(fā)現(xiàn)高甲基化區(qū)域的VTRNA2-1參與了CD4+T細(xì)胞的應(yīng)答和增殖，該區(qū)域?qū)е翪D4+的TCR信號(hào)強(qiáng)度降低，使得T細(xì)胞及其異常反應(yīng)和激活可能解釋了T輔助細(xì)胞的不平衡。

為了評估VTRNA2-1參與AD具體機(jī)制情況，我們進(jìn)行了RNA印跡分析和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了VTRNA2-1蛋白在活化細(xì)胞的上調(diào)，同時(shí)還測試了最豐富的PKR蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)VTRNA2-1在VTRNA2-1表達(dá)細(xì)胞中與PKR共免疫沉淀。既往在癌細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)VTRNA2-1與關(guān)聯(lián)并抑制RNA依賴的PKR蛋白，在人T細(xì)胞中也如此，由于VTRNA2-1具有細(xì)胞質(zhì)，可與PM1人類T細(xì)胞系中的PKR相互作用，同時(shí)VTRNA2-1可抑制人CD4+T細(xì)胞細(xì)胞系裂解物中介導(dǎo)的PKR活化[13,14]。VTRNA2-1的表達(dá)及其與PKR的相互作用可以作為控制PKR與各種信號(hào)通路相互作用的能力的開關(guān)，這種開關(guān)改變通路的存在，其中PKR在病程進(jìn)展參與抗增殖促凋亡的作用，因此可以解釋VTRNA2-1的高表達(dá)狀態(tài)可能是激活相關(guān)PKR信號(hào)傳導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)因子[15]。

綜上所述，VTRNA2-1在AD患者的CD4+T淋巴細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，VTRNA2-1表達(dá)升高可能加重患者臨床癥狀嚴(yán)重程度，因此VTRNA2-1可能是是T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥的標(biāo)志物，其機(jī)制可能是通過人類細(xì)胞中PKR依賴性信號(hào)傳導(dǎo)和相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑，在AD病理過程中發(fā)揮調(diào)控作用，可作為未來臨床治療靶標(biāo)。