鄧 倩，王 羊，鄧群仙*，張慧芬，夏 惠，林立金，呂小平，廖文飛

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.四川省廣安市鄰水縣經(jīng)果技術(shù)推廣所，四川鄰水 638500；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，成都 611130）

‘羅江調(diào)元棗’原產(chǎn)四川盆地高溫高濕寡日照地區(qū)的德陽市羅江區(qū)，果實(shí)長圓柱形，糖高酸低，味甜，是四川主栽鮮食棗品種[1]。‘圓形小酸棗’是廣泛分布于我國酸棗產(chǎn)區(qū)的灌木，果實(shí)圓球形，酸高糖低，味酸，為常用藥用植物及栽培棗砧木[2]。

糖是果實(shí)品質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)的主要成分之一。糖產(chǎn)生水果最重要的口味感覺——甜[3]。但是果實(shí)的甜味是由糖的種類、含量及比例共同決定的。不同種類，甚至同一種類不同品種的果實(shí)，可溶性糖構(gòu)成都可能存在差異，多數(shù)果實(shí)以蔗糖、果糖和葡萄糖為主要可溶性糖[4]。桃中蔗糖含量約占總可溶性糖的73%[5]，蘋果中果糖含量最高[6]。荔枝有蔗糖積累型、單糖積累型、蔗糖與單糖含量相當(dāng)?shù)?種類型[7]?！本╇u蛋棗’和‘延川酸棗A’（灌木型）成熟時(shí)果糖含量最高，為己糖積累型；但‘延川酸棗B’（喬木型）、駿棗和冬棗在成熟期果實(shí)蔗糖含量最高[8-10]，為蔗糖積累型。

目前果實(shí)中可溶性糖代謝的研究主要集中在蘋果、葡萄、柑橘以及梨等樹種上，北方栽培棗品種‘冬棗’和‘駿棗’的全基因組測序和可溶性糖代謝研究也已見報(bào)道[9-12]。但南方鮮食棗品種的可溶性糖積累規(guī)律及其相關(guān)基因表達(dá)的研究較少，且由于南方光照弱、陰雨天多等原因?qū)е履戏皆耘鄺椆麑?shí)中可溶性糖的積累量低于北方栽培棗[13]，這對鮮食棗風(fēng)味的影響較大。新疆和北京地區(qū)種植的鮮食棗中可溶性糖的含量最高可達(dá)33.35%和37.15%[14-15]，而四川種植的‘羅江調(diào)元棗’可溶性糖含量僅為22%左右[2]。本試驗(yàn)以四川主栽鮮食棗品種‘羅江調(diào)元棗’為材料，以砧木品種‘圓形小酸棗’為對照。通過測定不同發(fā)育時(shí)期可溶性糖含量與組分，及相關(guān)代謝基因的表達(dá)量，進(jìn)一步分析‘羅江調(diào)元棗’和‘圓形小酸棗’的可溶性糖積累規(guī)律差異，為進(jìn)一步研究南方栽培棗品種中可溶性糖代謝及棗果實(shí)品質(zhì)與風(fēng)味的形成提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)園位于四川省德陽市羅江區(qū)白馬關(guān)鎮(zhèn)萬佛村五組（N 31°26′34′，E 104°46′18′），海拔約 660 m，屬于亞熱帶濕潤型，氣候溫和，四季分明，年均氣溫16.5℃，最高氣溫36.6℃，最低氣溫-6.7℃；年均降水量910 mm，年無霜期278 d，年均日照時(shí)數(shù)1 260 h。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樹為露地栽培鮮食棗品種‘羅江調(diào)元棗’（根蘗苗，用TYZ表示），株行距為2 m×3 m；露地栽培砧木酸棗品種‘圓形小酸棗’（根蘗苗，用SZ表示），株行距為2 m×3 m。棗樹生長結(jié)果正常，樹勢健壯、栽培管理基本一致。

每份材料分別選擇3株樹，單株為一小區(qū)，3次重復(fù)。于第二批花的盛花期，在樹冠外圍由棗股抽生的棗吊中部掛牌。選擇樹冠外圍與掛牌棗吊（由棗股抽生）上大小相似的果實(shí)，置冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室后立即放入-80℃超低溫冰箱中保存。材料皆于花謝后20 d開始采樣，前期（幼果期）每隔14 d采樣一次，中后期（果實(shí)膨大期至半紅期）至果實(shí)商品成熟期（果面至少有一半為赭紅色）每隔7 d采樣一次。每次采樣每份材料約60個(gè)果實(shí)。

1.3 可溶性糖的測定

可溶性糖的提取參照柴葉茂[16]的方法，略有改動(dòng)。用液氮將果實(shí)研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.5 g粉末放入 10 mL 離心管中，用 5 mL 乙醇-水（80∶20，V∶V）溶解，80℃水浴30 min，取出冷卻。將提取樣品在常溫下6 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到25 mL的容量瓶中，重復(fù)提取1次，定容。定容液經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾待測?？扇苄蕴堑臏y定參照馬小衛(wèi)[17]的方法，略有改動(dòng)。色譜柱選用Innoval NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（80∶20，V∶V），示差檢測器，流速1 mL/min，檢測池溫度40℃；柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.4 總RNA的提取與cDNA合成

RNA的提取參照改良CTAB法，cDNA的合成參照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒說明書進(jìn)行操作

1.5 PCR引物設(shè)計(jì)和反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測

糖代謝引物及內(nèi)參基因引物序列參考張春梅[9]報(bào)道的，序列見表 1。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)定量引物，引物的合成由擎科生物技術(shù)（成都）有限公司完成。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR

以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增檢測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異性和質(zhì)量。PCR體系為2×Taq Mix 10 μL，上下游引物各 0.8 μL，模板 1 μL，dd H2O 7.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 2 min；94℃ 30 s，退火 30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 熒光定量PCR分析

熒光定量PCR反應(yīng)程序按照TOYOBO公司的THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix without ROX試劑盒說明書在CFX Connect型實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad，USA）上進(jìn)行。反應(yīng)總體積 10 μL，包含THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix without ROX 5 μL，10 μmol/L 上下游引物各 0.4 μL，cDNA 模板 1 μL 和無RNA酶水3.2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性 5 s，退火 30 s，72℃延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)水平采用相對表達(dá)量2-ΔΔCt表示。以上所有試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，每次試驗(yàn)設(shè)陰性對照。UBQ為內(nèi)參基因。以‘圓形小酸棗’花后20 d的表達(dá)量為對照，其表達(dá)量為1。

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

運(yùn)用Micosoft Excel 2015進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并結(jié)合SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)發(fā)育過程中可溶性糖組分及含量的動(dòng)態(tài)分析

由棗和酸棗不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)可溶性糖含量的變化趨勢可知（圖 1），‘羅江調(diào)元棗’和‘圓形小酸棗’果實(shí)發(fā)育早期（花后20～48 d）的主要糖組分均為果糖和葡萄糖，占總糖含量的80%以上；在果實(shí)發(fā)育中后期（花后55～90 d）蔗糖含量迅速上升?；ê?0 d時(shí)‘圓形小酸棗’果實(shí)中蔗糖占總糖含量的54.26%，果糖和葡萄糖占總糖含量的45.74%；‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中蔗糖含量占總糖含量的77.39%，果糖和葡萄糖含量占總糖含量的22.61%。由此可見，‘圓形小酸棗’果實(shí)在發(fā)育過程中是蔗糖和己糖共同積累，而‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)以積累蔗糖為主。

圖1 棗和酸棗果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期可溶性糖含量變化Figure 1 Changes of soluble sugar during development in jujube fruits

從糖含量整體變化來看，‘圓形小酸棗’中果糖、葡萄糖和蔗糖隨著果實(shí)的發(fā)育呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢；而‘羅江調(diào)元棗’中果糖和葡萄糖隨著果實(shí)的發(fā)育呈現(xiàn)上升-下降-上升的趨勢，蔗糖則在花后55 d開始迅速積累?；ê?6 d開始，‘羅江調(diào)元棗’和‘圓形小酸棗’的蔗糖、果糖和葡萄糖含量出現(xiàn)較大差異。

2.2 果實(shí)發(fā)育過程中可溶性糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

2.2.1 蔗糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析

圖 2為‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)蔗糖代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果。從圖 2A和2C可知，‘圓形小酸棗’中Zj SS1和Zj SS3的表達(dá)模式極為相似，花后20～62 d變化不大，花后69～76 d相對表達(dá)量急劇上調(diào)，花后83 d相對表達(dá)量下調(diào)，花后90 d相對表達(dá)量再次上調(diào)；‘羅江調(diào)元棗’中Zj SS1和Zj SS3的表達(dá)模式較為相似，果實(shí)發(fā)育前中期相對表達(dá)量上調(diào)，后期則相對表達(dá)量下調(diào)?！畧A形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中Zj SS2主要在花后76～90 d有高表達(dá)（圖 2B）。圖 2D～圖2F中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中Zj SPS1和Zj SPS2主要在果實(shí)發(fā)育后期（花后76 d之后）開始高表達(dá)；而Zj SPS4的表達(dá)趨勢為上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)，整體呈現(xiàn)“M”型變化。圖 2G～圖2J中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中Zjc INV3和Zjn INV1在花后20～48 d和花后90 d表達(dá)量較高，其他時(shí)期則基本不表達(dá)。且‘圓形小酸棗’果實(shí)中Zjc INV3和Zjn INV1在花后90 d的表達(dá)量遠(yuǎn)高于‘羅江調(diào)元棗’；Zjv INV2則在花后34 d有較高表達(dá)，其他時(shí)期表達(dá)量極低。‘圓形小酸棗’中Zjv INV1在花后48～55 d有高表達(dá)，其他時(shí)期表達(dá)量較低或基本不表達(dá)，‘羅江調(diào)元棗’中Zjv INV1基本不表達(dá)。

圖2 棗和酸棗果實(shí)蔗糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析Figure 2 The relative expression level of sucrose metabolism genes during developmental stages of jujube fruit

2.2.2 己糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析

圖3為‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期己糖代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)量。由圖3A和3C可知，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中Zj HK1的相對表達(dá)量隨著果實(shí)的成熟，表達(dá)逐漸下調(diào)；而Zj HK3在果實(shí)成熟期相對表達(dá)量最高，隨著果實(shí)的發(fā)育，其相對表達(dá)量上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)，呈現(xiàn)“N”型。圖 3B和圖3D中，‘圓形小酸棗’果實(shí)中Zj HK2和Zj HK5的相對表達(dá)量整體呈現(xiàn)下調(diào)再上調(diào)的變化趨勢；‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中Zj HK2和Zj HK5相對表達(dá)量無明顯變化規(guī)律?！畧A形小酸棗’果實(shí)中Zj HK6的相對表達(dá)量隨著果實(shí)的成熟逐漸上調(diào)，‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中Zj HK6的相對表達(dá)量在成熟期有高表達(dá)（圖 3E）?！畧A形小酸棗’果實(shí)中UGP的相對表達(dá)量隨著果實(shí)的成熟整體呈上調(diào)趨勢，而‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中UGP的相對表達(dá)量在花后20～69 d逐漸上調(diào)，花后76 d迅速上調(diào)后再下調(diào)（圖 3F）。圖 3G和圖3H中，‘圓形小酸棗’果實(shí)中Zj FK2在成熟期相對表達(dá)量較高；‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中Zj FK2的相對表達(dá)量隨著果實(shí)的成熟略微下調(diào)。‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中Zj FK4的表達(dá)則在果實(shí)發(fā)育前期上調(diào)，果實(shí)成熟期下調(diào)。

圖3 棗和酸棗果實(shí)己糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析Figure 3 The relative expression level of hexose metabolism genes during developmental stages of jujube fruit

2.3 果實(shí)發(fā)育過程中可溶性糖組分含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)分析

2.3.1 蔗糖含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)分析

由蔗糖含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)分析可知（表2），‘圓形小酸棗’的蔗糖含量與Zj SS1、Zj SS3、Zj SPS1和Zj SPS2的表達(dá)量極顯著正相關(guān)，與Zj SS2和Zjc INV3的表達(dá)量顯著正相關(guān)。‘羅江調(diào)元棗’的蔗糖含量與Zj SS2、Zj SPS1和Zj SPS2的表達(dá)量極顯著正相關(guān)，與Zj SS3的表達(dá)量顯著正相關(guān)。

表2 蔗糖含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis between sucrose content and related gene expression level

2.3.2 己糖含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)分析

由己糖含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)分析可知（表 3），‘圓形小酸棗’的果糖含量與Zj HK3和Zj HK6的表達(dá)量極顯著正相關(guān)，與Zj FK2、UGP、Zjn INV1和Zjc INV3的表達(dá)量顯著正相關(guān)，與Zj HK1和Zjv INV2的表達(dá)量顯著負(fù)相關(guān)?！畧A形小酸棗’的葡萄糖含量與Zj HK3、Zj HK6和Zj FK2的表達(dá)量極顯著正相關(guān)，與Zj HK5、UGP、Zjn INV1和Zjc INV3的表達(dá)量顯著正相關(guān)。而‘羅江調(diào)元棗’的果糖和葡萄糖含量僅與Zj FK4的表達(dá)量顯著正相關(guān)。

表3 己糖含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)分析Table 3 Correlation analysis between hexose content and related gene expression level

3 討論

3.1 棗和酸棗果實(shí)糖組分與含量

蒲小秋[18]檢測到‘冬棗’和‘駿棗’果實(shí)中以葡萄糖、果糖和蔗糖為主，占總糖含量的99%以上。本試驗(yàn)通過HPLC法檢測‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中的糖組分及含量，發(fā)現(xiàn)‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中的糖組分有蔗糖、果糖和葡萄糖，未檢測出山梨糖醇。HPLC試驗(yàn)結(jié)果表明‘羅江調(diào)元棗’為蔗糖積累型，這與林思思等[10]在‘冬棗’和‘駿棗’上的研究結(jié)果一致。‘圓形小酸棗’為蔗糖和己糖共同積累型，而‘延川酸棗A’（灌木型）屬于果糖積累型，‘延川酸棗B’（喬木型）屬于蔗糖積累型[9]。

3.2 棗和酸棗果實(shí)糖代謝基因?qū)μ墙M分的調(diào)控

糖代謝是一個(gè)循環(huán)的過程，果糖在蔗糖合酶（SS）的作用下可以合成蔗糖，而葡萄糖在己糖激酶（HK）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）和蔗糖磷酸合酶（SPS）等酶的作用下也可以合成蔗糖，但是蔗糖在轉(zhuǎn)化酶（INV）的作用下又能降解成果糖和葡萄糖[19]。

本研究分析了可溶性糖組分、含量與糖代謝相關(guān)基因在‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’不同發(fā)育階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)‘圓形小酸棗’蔗糖含量的變化與Zj SS1、Zj SS2、Zj SS3、Zj SPS1 和 Zj SPS2 表達(dá)量變化相似，這與Zhu X.D.等[20]在葡萄中得到的研究結(jié)果相似。且‘圓形小酸棗’蔗糖含量與ZjSS1、ZjSS2、ZjSS3、Zj SPS1和Zj SPS2存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，表明 Zj SS1、Zj SS2、Zj SS3、Zj SPS1 和 Zj SPS2 是‘圓形小酸棗’蔗糖代謝的關(guān)鍵基因。‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中蔗糖含量的變化與Zj SS2、Zj SS3、Zj SPS1和Zj SPS2表達(dá)量變化相似。Ji Y.等[21]利用高粱雜交實(shí)驗(yàn)得出SPS不僅是蔗糖積累的關(guān)鍵因素，也是引起甜高粱與普通高粱含糖量差異的因素的結(jié)論；且‘羅江調(diào)元棗’蔗糖含量與Zj SS2、Zj SS3、Zj SPS1 和Zj SPS2 存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，表明Zj SS2、Zj SS3、Zj SPS1和Zj SPS2是‘羅江調(diào)元棗’蔗糖代謝的關(guān)鍵基因。

‘圓形小酸棗’果實(shí)中果糖和葡萄糖含量的變化與Zjv INV1、Zjc INV3和Zjn INV1的表達(dá)量變化相反。張玲等[22]的研究結(jié)果顯示草莓果實(shí)發(fā)育過程中蔗糖積累與轉(zhuǎn)化酶呈顯著負(fù)相關(guān)，認(rèn)為隨著果實(shí)發(fā)育，F(xiàn)a.A/N-Invs編碼蛋白通過調(diào)控蔗糖分解，影響果實(shí)糖分積累，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似?！_江調(diào)元棗’果糖和葡萄糖含量與INV表達(dá)量變化無明顯相關(guān)關(guān)系。且相關(guān)分析表明，‘圓形小酸棗’果糖與葡萄糖含量變化與Zjc INV3和Zjn INV1的表達(dá)量顯著相關(guān)，‘羅江調(diào)元棗’果糖與葡萄糖含量變化與任一INV的表達(dá)量不存在顯著相關(guān)關(guān)系。蒲小秋[18]認(rèn)為棗果實(shí)中酸性轉(zhuǎn)化酶基因?qū)φ{(diào)控己糖平衡具有重要作用。郭雪飛等[23]對還原糖積累型棗果實(shí)‘金鈴圓棗’的研究表明，果實(shí)發(fā)育中后期中性轉(zhuǎn)化酶（IN）活性與己糖含量顯著正相關(guān)。因此，依據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果，可以推測Zjv INV1、Zjc INV3和Zjn INV1是‘圓形小酸棗’果糖和葡萄糖合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。

花后76 d開始，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’的蔗糖含量開始出現(xiàn)較大差異，到花后90 d‘羅江調(diào)元棗’的蔗糖含量比‘圓形小酸棗’高1/2，然而‘圓形小酸棗’許多發(fā)育時(shí)期的Zj SS2、Zj SS3、Zj SPS1和Zj SPS2表達(dá)量卻高于‘羅江調(diào)元棗’。這可能是葉片通過光合作用產(chǎn)生大量蔗糖，蔗糖通過長距離運(yùn)輸從源器官（葉片）到達(dá)庫器官（果實(shí)）后造成的差異[24]，這方面的推測還有待進(jìn)一步研究?；ê?6 d開始，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果糖和葡萄糖含量開始出現(xiàn)較大差距，到花后90 d‘圓形小酸棗’的果糖和葡萄糖含量比‘羅江調(diào)元棗’高1/2，這是由于在此期間‘圓形小酸棗’中Zjv INV1、Zjc INV3和Zjn INV1的表達(dá)量遠(yuǎn)高于‘羅江調(diào)元棗’所致。

4 結(jié)論

利用HPLC法測定了棗和酸棗果實(shí)中的糖組分與含量，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)所用‘圓形小酸棗’為蔗糖和己糖共同積累型，‘羅江調(diào)元棗’為蔗糖積累型。通過實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Zj SS1、Zj SS2、Zj SS3、Zj SPS1和Zj SPS2是‘圓形小酸棗’蔗糖合成的關(guān)鍵基因；Zj SS2、Zj SS3、Zj SPS1 和 Zj SPS2 是‘羅江調(diào)元棗’蔗糖合成的關(guān)鍵基因；Zjv INV1、Zjc INV3和Zjn INV1是‘圓形小酸棗’果糖和葡萄糖合成的關(guān)鍵基因。‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’糖積累規(guī)律的差異主要從花后76 d開始，兩者己糖的積累規(guī)律差異主要由Zjv INV1、Zjc INV3和Zjn INV1的差異表達(dá)所致，蔗糖的積累規(guī)律差異還有待進(jìn)一步研究。