曹小利，張葵，周輝，鄭潔，周萬青，張之烽，沈瀚(南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京210008)

近年來，由于產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)和/或AmpC型β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，碳青霉烯類抗菌藥物成為臨床治療多藥耐藥菌感染有效的抗菌藥物[1]。碳青霉烯耐藥大腸埃希菌(carbapenem-resistantEscherichiacoli, CREC)在世界范圍內(nèi)頻繁出現(xiàn)，已成為威脅公眾健康的主要病原菌。

目前已知，碳青霉烯酶的產(chǎn)生是腸桿科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制[2]，而新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NewDelhi metallo-β-lactamase, NDM)是大腸埃希菌中的主要碳青霉烯酶[2]。值得注意的是單菌可產(chǎn)多個β-內(nèi)酰胺酶，尤其是碳青霉烯酶的共同產(chǎn)生，如NDM-1和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶2(KlebsiellaPneumoniaecarbapenemase-2, KPC-2)的共產(chǎn)生[3]。迄今為止，KPC-2和OXA-48在多種臨床腸桿科細(xì)菌如肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和弗氏檸檬酸桿菌中的共存已被頻繁報道[4]。這種多個碳青霉烯酶編碼基因在單菌中的頻繁共存，不僅會導(dǎo)致碳青霉烯耐藥性迅速上升，也會導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率增加[5]，亟需關(guān)注。

中國碳青霉烯耐藥腸桿科細(xì)菌監(jiān)測網(wǎng)的報告和有關(guān)研究顯示，各地區(qū)CREC感染率存在顯著差異[6-7]。此外，多項(xiàng)研究表明，blaNDM通常位于IncX3質(zhì)粒上[8]，但關(guān)于這類菌株的毒力基因、血清分型和菌毛(Fim)分型的信息有限。本研究主要對CREC菌株的基因組流行病學(xué)進(jìn)行研究，包括耐藥基因、毒力因子、血清分型、Fim分型、質(zhì)粒復(fù)制子和進(jìn)化關(guān)系。此外，基于blaNDM和blaKPC的頻繁共存，篩查該類細(xì)菌在南京鼓樓醫(yī)院的分布，并分析了其播散特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1菌株來源 本研究的分離株包括兩部分。(1)南京市6家醫(yī)院2015年6—12月期間收集的11株非重復(fù)CREC分離株，進(jìn)行基因組特征分析。其中，4株分離自尿液，3株分離自痰液，1株來自血液，1株來自膽汁，1株來自子宮頸分泌物，還有1株來源不明；1株分離自南京明基醫(yī)院，2株分離自南京兒童醫(yī)院，1株分離自南京溧水醫(yī)院，4株分離自南京鼓樓醫(yī)院，1株分離自南京金域醫(yī)院，另外2株分別來自南京市婦幼保健院和南京市第一醫(yī)院。(2)南京鼓樓醫(yī)院2013—2017年間收集的43株連續(xù)非重復(fù)CREC菌，以確定共攜帶blaKPC-2和blaNDM的菌株。其中，分離時間為2013年的有4株，2014年10株，2015年2株，2016年11株，2017年16株； 18株來自中段尿，9株來自血，6株來自痰，3株來自分泌物，3株來自膽汁，2株來自腹水，2株來自膿液。

1.2儀器與試劑 Vitek 2.0細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)、引物合成及測序(擎科生物公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)、脈沖場凝膠電泳儀及配套試劑(Bio-Rad公司)、疊氮鈉和美羅培南(Sigma公司)、細(xì)菌基因組提取試劑盒DP705(北京天根公司)、NanoDrop 2000分光光度計(德國Thermo公司)、全基因組測序(廣東美格基因公司)、CLC genomics workbench軟件(蘇州協(xié)云基因公司)、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(德國ABI公司)、 BioNumerics軟件(上海一貝公司)、腸桿科細(xì)菌藥敏平板(溫州康泰生物公司)、分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.3抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法測定11株CREC菌株對抗菌藥物的敏感性。腸桿科細(xì)菌藥敏平板中的抗菌藥物包括厄他培南、亞胺培南、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢唑林、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、呋喃妥因、甲氧芐啶和磺胺甲噁唑、氨曲南、哌拉西林、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南/阿維巴坦、頭孢他啶/阿維巴坦和替加環(huán)素，大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)量控制菌株。藥敏結(jié)果根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2020指南進(jìn)行解釋[9]。替加環(huán)素和黏菌素的藥敏判讀參考?xì)W洲委員會的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)折點(diǎn) (http://www.eucast.org/clinical_breakpoints)。CREC菌株定義為對亞胺培南耐藥的菌株。

1.4基因組的DNA提取、測序、注釋、遞交 采用磁珠法通用型基因組DNA提取試劑盒(DP705)提取細(xì)菌基因組DNA后，使用分光光度計測定DNA濃度和純度。用于全基因組測序DNA樣品必須滿足下列條件：濃度≥20 ng/μL，總量≥2 μg，吸光度值在1.8～2.0之間。提取合格的DNA 樣本送廣東美格基因科技有限公司測序。測序過程如下：經(jīng)電泳檢測合格的DNA樣品用Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長度約為350 bp的片段，再經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成文庫制備；先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至2 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進(jìn)行檢測，片段符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。測序平臺采用Illumina Hiseq PE150，建庫類型為350 bp小片段文庫，細(xì)菌重測序策略為350 bp文庫≥10。原始下機(jī)數(shù)據(jù)過濾測序質(zhì)量值低的reads(Qs≥20)，保留高質(zhì)量reads后，由CLC Genomics Workbenchv7.0.4進(jìn)行配對末端讀取的從頭組裝。然后將基因組提交至NCBI進(jìn)行注釋。

1.5基因組流行病學(xué)分析 用Resfinder v2.1(http://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder-2.1/)和Virulence Finder 2.0 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)鑒定抗菌藥物的耐藥基因和毒力因子；用多位點(diǎn)序列分型法(MLST) 2.0 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/)進(jìn)行菌株的序列分型(sequence type, ST)；用Plasmid Finder 2.1(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制子分型，用Serotype Finder 2.0(https://cge.cbs.dtu.dk/services/SerotypeFinder/)進(jìn)行血清學(xué)分型，用 FimTyper 1.0(https://cge.cbs.dtu.dk/services/FimTyper/)進(jìn)行Fim分型。

1.6系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 利用細(xì)菌的核心基因(同一性>95%；覆蓋率=100%)中檢測到的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，構(gòu)建11株CREC的核心基因組系統(tǒng)發(fā)育樹[10]。使用raxml 8.2.8軟件版本，采用一般時間可逆模型和100次引導(dǎo)計算最大似然樹[11]。使用Interactive Tree Of Life (https://itol.embl.de) 產(chǎn)生進(jìn)化樹[12]。

1.7共攜帶blaNDM和blaKPC-2大腸埃希菌的篩選 用PCR方法檢測blaKPC(KPC-Fm：5′-CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG-3′；KPC-Rm：5′-CTTGTCATCCTTGTTAGGCG-3′)和blaNDM(NDM-F：5′-GGTTTGGCGATCTGGTTTTC-3′；NDM-R：5′-CGGAATGGCTCATCACGATC-3′)基因[13]。PCR陽性產(chǎn)物送至擎科生物公司(中國南京)進(jìn)行純化和測序。使用chromas pro應(yīng)用程序和BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)一步分析序列。

1.8脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE) 6株共攜帶blaNDM和blaKPC-2的大腸埃希菌分離株(包括11個CREC中的3株和南京鼓樓醫(yī)院43株CREC中的3株)通過PFGE進(jìn)一步分析遺傳相關(guān)性[14]。將新鮮菌落與蛋白酶K混合制成模塊，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ消化模塊，在PFGE CHEF-DRⅢ系統(tǒng)中，在0.5×Tris-borate-EDTA緩沖液中進(jìn)行電泳，電泳條件為：切換時間2.2～54.2 s，電場強(qiáng)度6 V/cm，電場夾角120°，電泳時間18.5 h。使用BioNumerics 8.0軟件分析條帶模式。

1.9接合試驗(yàn) 對于共攜帶blaKPC和blaNDM的6株細(xì)菌，進(jìn)行肉湯法接合以分析這些基因的可轉(zhuǎn)移性[7]，抗疊氮鈉大腸埃希菌J53作為受體菌。將新鮮菌落接種至5 mL LB肉湯中，在37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)。5 h后，將500 μL受體細(xì)胞和100 μL供體混勻于5 mL LB肉湯中，37 ℃過夜培養(yǎng)，然后取100 μL涂布于含有30 mg/L頭孢西丁和100 mg/L疊氮鈉的LB平板上。為篩選接合子，對于篩選平板上長出來的菌落，每株細(xì)菌挑5個菌落轉(zhuǎn)種至含30 mg/L頭孢西丁和100 mg/L疊氮鈉的LB平板上分純擴(kuò)增后，水煮法提取基因組DNA，使用PCR法檢測菌落中blaKPC和blaNDM基因；使用Eric-PCR(引物序列為EricF：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和EricR：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)檢測接合子與供體菌和受體菌之間的遺傳相關(guān)性。如果檢測菌落與受體菌有遺傳相關(guān)性，并且攜帶有blaKPC和/或blaNDM基因，即本實(shí)驗(yàn)所獲得的接合子。

2 結(jié)果

2.111株CREC的藥物敏感性 11株CREC菌株對β-內(nèi)酰胺類(包括碳青霉烯類)、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(包括頭孢他啶/阿維巴坦)和氟喹諾酮類藥物均耐藥。對甲氧芐啶磺胺甲噁唑、慶大霉素、阿米卡星和呋喃妥因的耐藥率分別為72.7%、36.4%、18.1%和9.1%。11株細(xì)菌對替加環(huán)素、多黏菌素和氨曲南/阿維巴坦均敏感(表1)。與攜帶blaNDM菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)相比，共攜帶blaNDM和blaKPC的菌株對所有抗菌藥物的MIC并沒有明顯升高。

表1 11株碳青霉烯耐藥大腸埃希菌對抗菌藥物的最低抑菌濃度(mg/L)

2.211株CREC的基因組流行病學(xué)特點(diǎn) 見表2?；蚪M分析顯示，11株CREC菌株中，9株細(xì)菌攜帶blaNDM-5基因，2株攜帶blaNDM-1，3株共攜帶blaNDM-5和blaKPC-2；10株細(xì)菌攜帶blaCTX-M，其中，4株攜帶blaCTX-M-55，2株攜帶blaCTX-M-65，2株攜帶blaCTX-M-14，2株攜帶blaCTX-M-15；3株細(xì)菌產(chǎn)AmpC酶，其中2株產(chǎn)blaCMY-2，1株產(chǎn)blaCMY-43；11株細(xì)菌中檢出5種質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(PMQRs)，包括2株攜帶oqxAB，1株攜帶qnrA1，4株攜帶qnrS1，4株攜帶aac(6′)-Ib-cr，1株攜帶qepA；4株細(xì)菌攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(PMGST)基因fosA3(圖1)。毒力基因分析發(fā)現(xiàn)12種毒力基因，其中g(shù)ad分布于9株細(xì)菌中，lpfA和iss分布于7株細(xì)菌中，其他毒力基因包括astA(分布于3株細(xì)菌)、cma(分布于3株細(xì)菌)、capU(分布于3株細(xì)菌)、iroN(分布于2株細(xì)菌)、sat(分布于1株細(xì)菌)、senB(分布于1株細(xì)菌)、sepA(分布于1株細(xì)菌)、iha(分布于1株細(xì)菌)和cnf1(分布于1株細(xì)菌)(表3)。

表2 11株碳青霉烯耐藥大腸埃希菌的基因組學(xué)特征

表3 11株碳青霉烯大腸埃希菌中耐藥基因、毒力基因和質(zhì)粒復(fù)制子的分布

MLST分析發(fā)現(xiàn)7個不同的ST，2株細(xì)菌為ST410，6株細(xì)菌的ST分別為ST156、ST167、ST297、ST361、ST683和ST3489，另外3株細(xì)菌的ST為新型，尚未命名(圖1)。11株細(xì)菌的血清型分為 5個O群(O8、O9、O25、O30、O89)和8個H群(H4、H9、H10、H21、H26、H30、H40和H45)。FimH分型鑒定了8 種Fim型, 包括2個Fim23，2個 Fim24，1個 Fim31，1個Fim34，1個Fim38，1個 Fim54，1個Fim121和1個Fim276。

注：CHβLs，碳青霉烯水解β-內(nèi)酰胺酶; ESBLs，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶; pAmpCs，質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶; 16S-RMTase，外源性獲得的16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶; PMGST，質(zhì)粒介導(dǎo)的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶。圖1 11株碳青霉烯耐藥大腸埃希菌的熱圖

共檢測到7種質(zhì)粒復(fù)制子。其中，11株細(xì)菌均攜帶IncX3復(fù)制子。7株細(xì)菌攜帶IncFⅡ復(fù)制子，6株細(xì)菌攜帶IncFIB復(fù)制子，3株攜帶IncI1復(fù)制子，3株攜帶IncFIA復(fù)制子，2株攜帶IncY復(fù)制子，2株攜帶IncFIC復(fù)制子。

2.311株CREC菌株的系統(tǒng)發(fā)育特征 系統(tǒng)發(fā)育樹雖然顯示11株CREC菌株有很大的遺傳多樣性，但從整體上看，11株CREC進(jìn)化成2個主要分支(圖1)，其中南京兒童醫(yī)院分離到的2株細(xì)菌具有密切的進(jìn)化關(guān)系。

2.4共攜帶blaNDM-5和blaKPC-2菌株的流行情況 在南京鼓樓醫(yī)院2013—2017年收集的43株CREC中，6株細(xì)菌攜帶blaKPC-2，23株細(xì)菌攜帶blaNDM基因，2株共攜帶blaNDM-5和blaKPC-2，1株共攜帶blaNDM-1和blaKPC-2。共攜帶blaNDM和blaKPC的3株細(xì)菌中，1株于2014年從ICU住院患者尿液中分離，另2株于2017年從不同患者的腹水和痰中分離。

2.5blaKPC和blaNDM共攜帶菌株的遺傳相關(guān)性 PFGE顯示共攜帶blaKPC和blaNDM的6株大腸埃希菌的遺傳呈高度的多樣性(圖2)，表明這些菌株不是來自同一克隆。

注：樹形圖是基于Dice相似系數(shù)由UPGMA算法生成，依據(jù)PFGE圖譜85%的相似性定義為6個PFGE組。圖2 基于脈沖場凝聚凝聚電泳圖譜產(chǎn)生的6株共攜帶blaKPC-2和 blaNDM大腸埃希菌的樹狀圖

2.6blaKPC和blaNDM的可轉(zhuǎn)移性 接合試驗(yàn)表明，6株菌株的blaNDM均能轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌J53中。然而，接合子中并沒有檢測到blaKPC基因，表明blaKPC可能和blaNDM不在同一質(zhì)粒上。

3 討論

本研究中來自6家醫(yī)院的11株CREC細(xì)菌對臨床治療中常用的抗菌藥物表現(xiàn)出的高耐藥性與以往的報道一致[15]，表明對此類菌株引起的感染所能選擇的抗菌藥物相當(dāng)有限。替加環(huán)素、多黏菌素和氨曲南/阿維巴坦的敏感性很好。當(dāng)比較只攜帶blaNDM的菌株與共攜帶blaKPC和blaNDM的菌株對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的MIC時，單個分離株中blaKPC和blaNDM的同時存在似乎并不能導(dǎo)致對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的更高耐藥性，但本研究中此類細(xì)菌數(shù)目有限，結(jié)果有待驗(yàn)證。此外，據(jù)報道，厄他培南對產(chǎn)生NDM-5菌株的MIC比對產(chǎn)NDM-1菌株的MIC高4倍或8倍[16]，但本研究沒有觀察到這樣的現(xiàn)象，這可能與其他耐藥機(jī)制如ESBLs和AmpC酶的產(chǎn)生、外排泵的過表達(dá)、外膜通透性降低等的存在有關(guān)。

在本研究中，11株CREC中blaNDM的高流行率與以往的報道一致[8]，表明NDM是介導(dǎo)大腸埃希菌對碳青霉烯類耐藥的主要碳青霉烯酶，這可能與大腸埃希菌和blaNDM質(zhì)粒的適應(yīng)性有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NDM-5是最常見的NDM，這與目前的流行病學(xué)數(shù)據(jù)一致[8]，表明NDM-5是大腸埃希菌中的主要NDM酶。在醫(yī)院內(nèi)，NDM-5主要存在于高危流行克隆ST167、ST410和ST101中[17]，這可能與大腸埃希菌克隆群的成功播散和NDM-5表達(dá)質(zhì)粒的水平基因轉(zhuǎn)移有關(guān)。雖然ST131作為一種多藥耐藥克隆型已在全世界廣泛傳播，而在本研究中沒有檢測到ST131。本研究發(fā)現(xiàn)了多個不同的STs，表明這些CREC的克隆多樣性，也與本研究系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致。雖然NDM-5已在大腸埃希菌ST410、ST156和ST167中被報道[7]，但產(chǎn)NDM-5的大腸埃希菌ST297、ST683和ST3489以及產(chǎn)NDM-1的大腸埃希菌ST361以前未見報道。

盡管在CREC中發(fā)現(xiàn)了多個質(zhì)粒復(fù)制子，但攜帶blaNDM的質(zhì)粒主要有IncX3、IncFⅡ或IncC?？紤]到在所有攜帶blaNDM的大腸埃希菌中均有IncX3質(zhì)粒復(fù)制子，推測IncX3是blaNDM的主要宿主[18]。本研究中接合實(shí)驗(yàn)表明，blaNDM的傳播并沒有伴隨blaKPC-2的轉(zhuǎn)移，表明blaNDM和blaKPC-2可能并沒有在同一質(zhì)粒上。

毒力基因分析顯示CREC中有幾個主要的毒力基因，其中g(shù)ad編碼谷氨酸脫羧酶，是耐酸系統(tǒng)的主要結(jié)構(gòu)成分，保護(hù)大腸埃希菌免受強(qiáng)酸(pH<3.0)壓力，通常在哺乳動物胃腸道中[19]；lpfA是一個假定的黏附基因，編碼腸出血性大腸埃希菌O157:H7菌毛，與宿主腸道定植相關(guān)，在細(xì)菌感染過程中發(fā)揮重要作用[19]；iss是最常見的禽致病性大腸埃希菌編碼基因，已被鑒定為與大腸埃希菌毒力相關(guān)的一種毒力特征，可引起家禽大腸埃希菌病[20]。這些毒力基因在CREC中的高流行率可能表明CREC主要定植于宿主腸道。1株從尿液中分離的CREC菌株不僅攜帶gad、iss和lpfA，而且還攜帶sat(分泌型自體轉(zhuǎn)運(yùn)毒素)、senB(質(zhì)粒編碼腸毒素)、sepA(志賀氏菌胞外蛋白a)、iha(黏附蛋白)和cnf1(細(xì)胞毒性壞死因子)。研究表明，sat可促進(jìn)一些未分化上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，并在某些引起泌尿和腸道感染的大腸埃希菌中高度流行[21]；cnf1經(jīng)常在臨床尿致病性大腸埃希菌分離株中表達(dá)，產(chǎn)Cnf1和β-溶血的大腸埃希菌常顯著引起人類的尿路和腦膜感染[22]?？傊?，這些毒力基因在CREC中的存在可能表明該菌株具有較高的致病性。

此外，發(fā)現(xiàn)O8:H9是最常見的血清型，這與以往的報道一致[23]，表明O8:H9是一種與多藥耐藥相關(guān)的臨床相關(guān)血清型。

綜上所述，基因組分析發(fā)現(xiàn)NDM是11株CREC菌株的主要碳青霉烯酶，KPC共存的發(fā)生率較高。這些CREC菌株的MLST、Fim分型、血清分型和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表現(xiàn)出遺傳多樣性，IncX3可能是NDM的主要質(zhì)粒，gad、iss和lpfA是主要的毒力基因；盡管檢測到blaNDM和blaKPC-2共攜帶菌株，但未發(fā)現(xiàn)克隆傳播；基于這些菌株對公眾健康的潛在威脅，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)感染控制措施。