跑輪運(yùn)動對小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元AKT/mTOR通路活性及運(yùn)動誘發(fā)電位的影響

易凌榮，譚波濤，詹祖雄，劉 媛，殷 櫻，虞樂華

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶 400010；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究部，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042

眾所周知，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷的修復(fù)是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的難題。脊髓損傷、腦損傷導(dǎo)致的大量軸突斷裂、脫髓鞘等改變是導(dǎo)致CNS損傷患者出現(xiàn)持久性功能喪失的重要原因。研究［1-3］表明，激活蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PKB/m TOR，AKT/m TOR）信號通路可有效增強(qiáng)神經(jīng)元的合成代謝，促進(jìn)細(xì)胞存活，提高內(nèi)源性軸突的再生能力。亦有研究［4］發(fā)現(xiàn)，激活m TOR通路可促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)髓鞘發(fā)育。因此，對中樞神經(jīng)元m TOR通路的調(diào)控有望成為脊髓損傷等疾病的重要治療靶點(diǎn)之一。既往研究［2-3］顯示，學(xué)者們多以敲除磷酸酶及張力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog，Pten）基因的方式調(diào)控m TOR通路。而由于Pten是一種腫瘤抑制基因，敲除后或?qū)⒃黾幽[瘤的發(fā)生風(fēng)險，因此尋找貼近臨床的生理性干預(yù)方式顯得尤為重要。

運(yùn)動是現(xiàn)代康復(fù)的核心。對于CNS而言，跑步訓(xùn)練不僅能增加皮質(zhì)、海馬和紋狀體等多個區(qū)域內(nèi)的腦血流量，誘導(dǎo)腦血管生成，增加成年神經(jīng)發(fā)生，還能夠增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、存活和分化，降低神經(jīng)退行性變的風(fēng)險［5］。新近研究［6-8］顯示，跑步訓(xùn)練后嚙齒動物的血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中的AKT/m TOR通路存在被激活的現(xiàn)象。但該運(yùn)動能否激活皮層神經(jīng)元AKT/m TOR通路以及何種強(qiáng)度具有更好的激活效應(yīng)，仍有待進(jìn)一步探索?；诖?，本研究通過不同強(qiáng)度的跑輪訓(xùn)練，探究其對成年小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元AKT/mTOR通路激活的影響，以期為CNS損傷患者制定運(yùn)動策略提供一定的理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑及儀器

6～8周齡健康成年雌性C57BL/6J小鼠24只［購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（湘）2019-0004］，體質(zhì)量為20～25 g。該小鼠于清潔級環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，使用許可證：SYXK（渝）2018-0003。于20～25℃、相對濕度40%～60%、保持12 h晝夜節(jié)律的條件下，小鼠按時攝入食物和水。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批［審批號：2020年科倫審第（161）號］，所有研究操作均遵守《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理實(shí)施細(xì)則》的要求。

BCA蛋白定量試劑盒（Thermo，美國），腦源性生長因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗 體、AKT抗體、磷酸化AKT（p-AKT）抗體、核糖體蛋白S6（ribosomal S6 protein，S6）抗體、磷酸化S6（p-S6）抗體（CST，美國），胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）抗體（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司），β-肌動蛋白（β-actin）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

小型垂直電泳儀（Bio-Rad，美國），化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司），PowerLab/16SP誘發(fā)電位儀（ADInstruments，澳大利亞），小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 分組和跑輪訓(xùn)練24只雌性小鼠被隨機(jī)分為對照組、低運(yùn)動強(qiáng)度（low exercise intensity，LEI）組、中等運(yùn)動強(qiáng)度（moderate exercise intensity，MEI）組、高運(yùn)動強(qiáng)度（high exercise intensity，HEI）組，每組6只。

跑輪訓(xùn)練共分為2個階段，包括3 d的預(yù)訓(xùn)練和1周的正式訓(xùn)練。預(yù)訓(xùn)練期間，小鼠每日以6m/m in的速度運(yùn)動15m in；在最后1次訓(xùn)練結(jié)束后，測試小鼠的最大運(yùn)動速度，即在原速度基礎(chǔ)上每間隔3m in增加0.6m/m in，逐漸增加速度直至小鼠被電擊10次后無法繼續(xù)訓(xùn)練（認(rèn)為其達(dá)到耗竭）。正式訓(xùn)練期間，LEI組小鼠以50%的最大速度、MEI組以75%的最大速度、HEI組以100%最大速度分別進(jìn)行訓(xùn)練［9］，每日運(yùn)動15m in；而對照組小鼠被放入跑道中，不進(jìn)行跑步訓(xùn)練。

1.2.2 上肢運(yùn)動誘發(fā)電位檢測 采用0.5%戊巴比妥鈉對運(yùn)動后的4組小鼠進(jìn)行麻醉，剔除頭顱頂部和右上肢毛發(fā)。切開頂部皮膚，用牙科鉆鉆開頭顱左側(cè)感覺運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)域顱骨，暴露出硬腦膜。將小鼠固定于立體定位儀上。刺激電極經(jīng)顱骨鉆開區(qū)域輕觸左側(cè)感覺運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)域硬腦膜，一對針狀記錄電極插入右上肢肱二頭肌中，參考電極固定于頭皮切口邊緣，地線接小鼠尾部。以頻率4 Hz、波寬0.2ms、強(qiáng)度5.0mA的電流刺激小鼠，檢測其右上肢運(yùn)動誘發(fā)電位（motor evoked potential，MEP）。每次檢測重復(fù)3次，獲得穩(wěn)定波形后記錄各波峰潛伏期，以反映神經(jīng)傳導(dǎo)情況。

1.2.3 運(yùn)動皮質(zhì)組織蛋白提取 取小鼠運(yùn)動皮質(zhì)，稱重后放入預(yù)冷的勻漿器中，加入適量的裂解液（每1mg組織對應(yīng)5μL裂解液），充分研磨至乳白色懸液后轉(zhuǎn)至離心管中。經(jīng)超聲破碎（300W破碎2 s，間隔10 s，持續(xù)1m in）后，將組織懸液靜置45m in。于4℃、15 000×g下離心15m in，將上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，即為運(yùn)動皮質(zhì)組織總蛋白樣品，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。1.2.4 運(yùn)動皮質(zhì)AKT/m TOR通路中關(guān)鍵蛋白和生長因子檢測 采用蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）對小鼠運(yùn)動皮質(zhì)AKT/m TOR通路中的關(guān)鍵蛋白和生長因子進(jìn)行檢測，具體操作詳見說明書。實(shí)驗(yàn)中使用的一抗為AKT抗體（1∶1 000）、p-AKT抗 體（1∶1 000）、S6抗 體（1∶1 000）、p-S6抗體（1∶1 000）、IGF1抗體（1∶500）、BDNF抗體（1∶1 000）和β-actin抗體（1∶2 000），使用二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶2 000）和山羊抗兔IgG（1∶3 000）。最終，于全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影和條帶分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0.2 和SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)以x±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，并采用Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行校正。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上肢M EP檢測分析

運(yùn)動訓(xùn)練1周后，MEP檢測結(jié)果（圖1）顯示，4組小鼠右上肢MEP的N1波、P1波潛伏期間均存在較大差異（P=0.000 ，P=0.015 ）。與對照組相比，3個運(yùn)動組小鼠的N1波潛伏期均有所縮短（均P＜0.05）；與HEI組相比，LEI組小鼠的N1波潛伏期更短（P=0.032）。同時，與對照組相比，LEI組小鼠的P1波潛伏期較短（P=0.015）。

圖1 4組小鼠上肢MEP分析Fig 1 Analysis of upper limb MEP in the four groups of mice

2.2 運(yùn)動皮質(zhì)AKT/m TOR通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)分析

Western blotting檢測結(jié)果（圖2）顯示，經(jīng)跑輪訓(xùn)練后，4組小鼠運(yùn)動皮質(zhì)中p-AKT、p-S6表達(dá)間均存在顯著差異（均P＜0.05）。與對照組相比，LEI組小鼠p-AKT/AKT比值較高（P=0.009），且MEI組和HEI組的p-AKT/AKT亦也有增加（均P＜0.05），但3個運(yùn)動組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時，與對照組相比，該3個運(yùn)動組小鼠的p-S6/S6均有增加（均P＜0.05），且LM I組高于MEI組高于HEI組，但運(yùn)動組間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 Western blotting檢測4組小鼠運(yùn)動皮質(zhì)中AKT/m TOR通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)Fig 2 Expression of key proteins of AKT/m TOR pathway in the motor cortex of the four groups by Western blotting

2.3 小鼠運(yùn)動皮質(zhì)AKT/m TOR通路中生長因子的表達(dá)分析

Western blotting檢測結(jié)果（圖3）顯示，與對照組相比，LEI組小鼠運(yùn)動皮質(zhì)中IGFI、BDNF和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的前體（precursor of BDNF，pro-BDNF）的表達(dá)均較高（均P＜0.05）。

圖3 Western blotting檢測對照組和LEI組小鼠運(yùn)動皮質(zhì)中生長因子的表達(dá)Fig 3 Expression of growth factor in the motor cortex of mice in the control group and LEI group by Western blotting

3 討論

運(yùn)動強(qiáng)度是運(yùn)動效果的重要影響因素之一。本課題組前期采用偏技巧性的低強(qiáng)度訓(xùn)練（即單粒小丸抓取訓(xùn)練）刺激脊髓損傷小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠皮層神經(jīng)元m TOR通路無明顯激活現(xiàn)象［10］；繼而說明刺激m TOR通路需要一定的全身性肌肉調(diào)動，同時也提示跑步運(yùn)動可能是成年小鼠更為理想的訓(xùn)練方式。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腦血流量可隨著跑步運(yùn)動強(qiáng)度的增加而增大，當(dāng)達(dá)到最大運(yùn)動強(qiáng)度的60%后，腦血流量將出現(xiàn)平穩(wěn)期甚至逐漸下降［11］；繼而說明，超過一定的運(yùn)動強(qiáng)度機(jī)體可能不會有更好的獲益。另有研究［12］顯示，低強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練時乳酸的表達(dá)量可稍高過其閾值，這對提高生長相關(guān)蛋白43（growth associated protein，GAP43）的表達(dá)有較好的效果，說明低強(qiáng)度是促進(jìn)神經(jīng)再生的理想強(qiáng)度；而高強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練會產(chǎn)生過多的乳酸和皮質(zhì)酮，從而抑制GAP43的表達(dá)。Cobianchi等［13］研究顯示，低強(qiáng)度至中強(qiáng)度運(yùn)動后嚙齒動物腰髓BDNF的表達(dá)有所增加；而高強(qiáng)度跑步訓(xùn)練后，其背根神經(jīng)節(jié)及脊髓中的BDNF水平均會降低。該結(jié)果提示，低至中等強(qiáng)度的運(yùn)動比高強(qiáng)度更能促進(jìn)神經(jīng)生長因子的表達(dá)，有助于神經(jīng)發(fā)生，而高強(qiáng)度的運(yùn)動可能會對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生有害作用。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度的跑輪運(yùn)動對小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的AKT/m TOR通路有較好的激活作用，未來還需對CNS損傷狀態(tài)下該強(qiáng)度的訓(xùn)練是否存在類似作用進(jìn)行探究。

神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放是運(yùn)動訓(xùn)練中重要的正向效應(yīng)，其核心因子BDNF和IGF1可通過與相對應(yīng)的酪氨酸受體激酶B受體和IGF1受體結(jié)合介導(dǎo)酪氨酸殘基的自磷酸化，激活下游的AKT/mTOR通路［14-15］，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)形成、脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)錄等細(xì)胞生物學(xué)過程，在成體神經(jīng)元的存活、生長、神經(jīng)發(fā)生和軸突再生等方面發(fā)揮重要作用［16-18］。本研究結(jié)果顯示，低強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練可上調(diào)運(yùn)動皮質(zhì)中IGF1和BDNF的表達(dá)水平；繼而表明，皮質(zhì)神經(jīng)元AKT/m TOR通路在跑輪訓(xùn)練后被激活，可能與生長因子IGF1和BDNF含量的升高有關(guān)。

本研究的神經(jīng)電生理結(jié)果顯示，低強(qiáng)度跑輪訓(xùn)練對提高小鼠神經(jīng)傳導(dǎo)具有積極作用。CNS的傳導(dǎo)時間與髓鞘的功能密切相關(guān)，軸突無髓間隙的髓鞘化可引起傳導(dǎo)速度提升［19］。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，3周的跑步訓(xùn)練可增強(qiáng)大鼠運(yùn)動皮質(zhì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)該類細(xì)胞向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，有利于軸突髓鞘形成［12］。本研究發(fā)現(xiàn)跑輪訓(xùn)練可縮短MEP的潛伏期，究其原因，可能是由于生長因子通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路誘導(dǎo)髓鞘厚度增加，從而提高了神經(jīng)傳導(dǎo)速度所致。未來，有關(guān)跑輪訓(xùn)練對髓鞘的影響還需行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上所述，跑輪運(yùn)動可激活小鼠運(yùn)動神經(jīng)元AKT/m TOR通路，增強(qiáng)神經(jīng)傳導(dǎo)；且低強(qiáng)度的運(yùn)動效果更好，或可作為臨床上運(yùn)動訓(xùn)練強(qiáng)度選擇的參考。后續(xù)，相關(guān)研究還需在具體的疾病模型中探索運(yùn)動強(qiáng)度對神經(jīng)可塑性和功能恢復(fù)的機(jī)制和作用，以期為臨床上CNS損傷的患者運(yùn)動治療提供新的理論基礎(chǔ)。

參·考·文·獻(xiàn)

[1]Saxton RA,Sabatini DM.mTOR signaling in growth,metabolism,and disease[J].Cell,2017,168(6):960-976.

[2]Park KK,Liu K,Hu Y,et al.Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/m TOR pathway[J].Science,2008,322(5903):963-966.

[3]Liu K,Lu Y,Lee JK,et al.PTEN deletion enhances the regenerative ability of adult corticospinal neurons[J].Nat Neurosci,2010,13(9):1075-1081.

[4]Goebbels S,Wieser GL,Pieper A,et al.A neuronal PI(3,4,5)P3-dependent program of oligodendrocyte precursor recruitment and myelination[J].Nat Neurosci,2017,20(1):10-15.

[5]Vivar C,Potter MC,van Praag H.All about running:synaptic plasticity,growth factors and adult hippocampal neurogenesis[J].Curr Top Behav Neurosci,2013,15:189-210.

[6]Bao C,Yang Z,Li Q,et al.Aerobic endurance exercise ameliorates renal vascular sclerosis in aged mice by regulating PI3K/AKT/m TOR signaling pathway[J].DNA Cell Biol,2020,39(2):310-320.

[7]Yu Q,Xia ZY,Liong EC,et al.Chronic aerobic exercise improves insulin sensitivity and modulates Nrf2 and NF-κB/IκBα pathways in the skeletal muscle of rats fed with a high fat diet[J].Mol Med Rep,2019,20(6):4963-4972.

[8]Li JJ,Liu YR,Liu BB,et al.Mechanisms of aerobic exercise upregulating the expression of hippocampal synaptic plasticity-associated proteins in diabetic rats[J].Neural Plast,2019,2019:7920540.

[9]Vieira RP,Claudino RC,Duarte ACS,et al.Aerobic exercise decreases chronic allergic lung inflammation and airway remodeling in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,176(9):871-877.

[10]Pan L,Tan BT,Tang WW,et al.Combining task-based rehabilitative training with PTEN inhibition promotes axon regeneration and upper extremity skilled motor function recovery after cervical spinal cord injury in adult mice[J].Behav Brain Res,2021,405:113197.

[11]Smith KJ,MacLeod D,Willie CK,et al.Influence of high altitude on cerebral blood flow and fuel utilization during exercise and recovery[J].J Physiol,2014,592(24):5507-5527.

[12]Jung SY,Kim DY,Yune TY,et al.Treadmill exercise reduces spinal cord injury-induced apoptosis by activating the PI3K/Akt pathway in rats[J].Exp Ther Med,2014,7(3):587-593.

[13]Cobianchi S,Arbat-Plana A,Lopez-Alvarez VM,et al.Neuroprotective effects of exercise treatments after injury:the dual role of neurotrophic factors[J].Curr Neuropharmacol,2017,15(4):495-518.

[14]Kowiański P,Lietzau G,Czuba E,et al.BDNF:a key factor with multipotent impact on brain signaling and synaptic plasticity[J].Cell Mol Neurobiol,2018,38(3):579-593.

[15]Dyer AH,Vahdatpour C,Sanfeliu A,et al.The role of insulin-like growth factor 1(IGF-1)in brain development,maturation and neuroplasticity[J].Neuroscience,2016,325:89-99.

[16]Halmos T,Suba I.The physiological role of growth hormone and insulinlike growth factors[J].Orv Hetil,2019,160(45):1774-1783.

[17]Cooper C,Moon HY,van Praag H.On the run for hippocampal plasticity[J].Cold Spring Harb Perspect Med,2018,8(4):a029736.

[18]Kennedy BK,Lamming DW.The mechanistic target of rapamycin:the grand conducTOR of metabolism and aging[J].Cell Metab,2016,23(6):990-1003.

[19]Salzer JL,Zalc B.Myelination[J].Curr Biol,2016,26(20):R971-R975.