張珂，張?zhí)找?，黃慧明

武漢大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430072

前言

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）是從原發(fā)性腫瘤脫落經(jīng)過遷移轉(zhuǎn)化等過程進(jìn)入外周血液循環(huán)的癌細(xì)胞，其攜帶著腫瘤部位的全部信息［1-2］。有研究表明，CTCs 隨著血液循環(huán)可以在人體的不同組織處沉降繼而形成繼發(fā)性腫瘤，是造成癌癥患者死亡的主要原因［3］。對患者血液中分離出的CTCs 進(jìn)行分子學(xué)分析，不僅有助于了解腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理，而且對癌癥診斷、預(yù)后疾病監(jiān)測和個(gè)性化治療起著至關(guān)重要的作用［4-8］。獲得高活性的CTCs 對隨后的分子學(xué)分析具有十分重要的意義。近年來，開發(fā)了各種方法用于從癌癥患者血液中分離CTCs，包括免疫磁分離、微流控技術(shù)、密度梯度離心、流式細(xì)胞術(shù)和靜態(tài)細(xì)胞分離技術(shù)等［9-13］。雖然這些方法各有優(yōu)點(diǎn)，但從血液中分離得到高活性的CTCs 仍面臨一定的技術(shù)挑戰(zhàn)。首先，CTCs在血液中含量極少；其次，在CTCs 分離的過程中，細(xì)胞活性會(huì)受到影響。例如，在梯度密度離心分離時(shí)，長時(shí)間的分離過程會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性并干擾細(xì)胞的微結(jié)構(gòu)［14-16］；利用微流控芯片分離CTCs 時(shí)，細(xì)胞在芯片中流動(dòng)時(shí)受流體動(dòng)力學(xué)作用，CTCs 擠壓到硬質(zhì)硅或玻璃過濾器時(shí)產(chǎn)生的外部壓力會(huì)破壞和影響CTCs 完整性和生存能力［17-18］。因此，需要采用更加優(yōu)良的分離方法來獲得具有高活力的CTCs，以便更好地用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)和分子分析。

為獲得具有高活力的CTCs，需要更加溫和的分離方法。靜態(tài)細(xì)胞分離方法捕獲細(xì)胞過程溫和，通常是捕獲基底和細(xì)胞在合適的條件下共孵育，利用捕獲基底結(jié)合特異性捕獲抗體，從而實(shí)現(xiàn)對CTCs 的捕獲，對細(xì)胞活性損傷極小。其中，基于二氧化錳（MnO2）、二氧化鈦（TiO2）等基底被廣泛應(yīng)用于CTCs捕獲［19-20］。Huang 等［21］制備了一種基于MnO2薄膜平面基底，引入EpCAM 抗體作為親和捕獲分子來識(shí)別和捕獲CTCs，然后通過低濃度草酸溶解MnO2膜來釋放CTCs。Li 等［22］制備了涂有MnO2顆粒的TiO2柱基底來捕獲CTCs，并通過草酸來釋放CTCs。

迄今為止，大多數(shù)的研究都集中在CTCs 的捕獲，但是也應(yīng)該關(guān)注CTCs 的下游分析，例如增殖、基因分析等，故控制細(xì)胞釋放而不受損害對于后續(xù)細(xì)胞分析至關(guān)重要。有研究表明，當(dāng)抗體作為捕獲劑時(shí)，CTCs 回收方法大多為對細(xì)胞膜外抗原蛋白的水解消化，例如胰蛋白酶和EDTA 等，這種類型的釋放過程在一定程度上影響細(xì)胞活力，必須要精確控制反應(yīng)時(shí)間和試劑濃度［23］。另外，還可以通過熱力學(xué)釋放、電化學(xué)釋放、激光刺激等實(shí)現(xiàn)在抗體修飾的基底上CTCs 的釋放?？紤]到實(shí)際捕獲和釋放CTCs 復(fù)雜而精細(xì)的操作方法，亟需一種更加簡單而可行的方法。Sun 等［24］提出一種新穎的集捕獲和原位培養(yǎng)CTCs 于一體的方法，利用電噴霧在基底制備一層殼聚糖顆粒，將PEG 分子連接到殼聚糖顆粒上，然后綴合上細(xì)胞特異性適配體DNA，實(shí)現(xiàn)對CTCs的高效捕獲。由于殼聚糖是細(xì)胞組織工程的天然衍生物，無毒且細(xì)胞相容性好，可實(shí)現(xiàn)對捕獲細(xì)胞的原位培養(yǎng)。血液中CTCs 數(shù)量極少，因此稀有CTCs 的增殖將會(huì)是進(jìn)一步進(jìn)行分子表征和功能分析的重要嘗試［24］。目前鮮見有關(guān)于基底捕獲的稀有CTCs 的原位培養(yǎng)的研究。原位培養(yǎng)可減少釋放過程中對細(xì)胞活性的損害，這種方法給我們提供了一種新的思路。在基底捕獲中，選擇生物相容性好且適合細(xì)胞培養(yǎng)的基底材料可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)CTCs的捕獲和原位培養(yǎng)。

明膠是天然的生物高分子材料，無毒且生物相容性好，是細(xì)胞培養(yǎng)良好的基質(zhì)材料［25-26］。明膠分子鏈含有氨基、羧基等官能團(tuán)，有利于功能修飾，且明膠價(jià)格便宜，來源易得。本實(shí)驗(yàn)制備了一個(gè)明膠膜基底來捕獲和原位培養(yǎng)CTCs。通過在小培養(yǎng)皿底上制備一層明膠膜基底，引入抗體作為親和捕獲分子實(shí)現(xiàn)對CTCs的捕獲；對捕獲到的細(xì)胞進(jìn)行原位培養(yǎng)可進(jìn)一步增殖稀有細(xì)胞，用于后續(xù)分子表征和功能分析。該方法具有巨大的潛在價(jià)值，并且有望在臨床上發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）購于阿拉丁試劑（上海）有限公司。戊二醛水溶液（25%）、無水乙醇（AR,≥99.7%）購于中國國藥化學(xué)試劑有限公司。明膠（A 型）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、嗎啉乙磺酸（MES）、熒 光 素二 乙 酸酯（Fluorescein Diacetate,FDA）、碘化丙啶（Propidium, PI）、honest33258、多聚甲醛（PFA, 4%）、Tween-20、人白細(xì)胞分離液（Ficoll-Paque）購于Sigma-Aldrich 公司。生物素標(biāo)記的上皮細(xì)胞粘附因子抗體（anti-EpCAM）購于R&D systerms公司。磷酸鹽緩沖液（PBS）（Hyclone, 1X）和細(xì)胞培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM,Hyclone, 高糖）、胎牛血清（FBS）、正常山羊血清（NGS）、牛血清白蛋白（BSA）、0.25%Trypsin-EDTA（Gibco,1X）購于賽默飛世爾科技公司。PE標(biāo)記的抗細(xì)胞角蛋白（CK）（CAM5.2）、FITC 標(biāo)記的抗人CD45（Ms IgG, clone H130）購于BD Biosciences。鏈霉親和素（SA）購于Solarbio。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人的乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7）在DMEM 培養(yǎng)基中孵育。培養(yǎng)基分別補(bǔ)充有10%的熱滅活FBS 和1%的鏈霉素-青霉素。每3 d 更換一次培養(yǎng)基。所有細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCF-7由武漢大學(xué)中南醫(yī)院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 明膠膜基底的制備及抗體修飾（1）明膠膜基底制備。戊二醛作為交聯(lián)劑，在基底上形成一層明膠膜。小培養(yǎng)皿用酒精清洗干凈并放入烘箱中烘干后放入plasma 機(jī)中處理15 min，然后加入無水乙醇配置的2%的APTES 溶液，室溫下放置4 h。分別用無水乙醇和DI 水清洗基底3 遍后加入5%的戊二醛水溶液37 ℃反應(yīng)30 min；然后用DI水沖洗基底3次；接著加入PBS 配置的5%的明膠溶液，37 ℃下反應(yīng)30 min；反應(yīng)完成后，用PBS 清洗基底3 次，烘干后放入4 ℃冰箱備用。

（2）明膠膜基底抗體修飾。向制備好的明膠膜基底加入EDC（4 mg/mL）和NHS（6 mg/mL）溶液（MES 配置），37 ℃反應(yīng)30 min，分別用MES 和PBS洗3 次。加入SA 溶液（0.1 mg/mL），37 ℃反應(yīng)1 h 后用PBS 洗3 次；加入anti-EpCAM 溶液（1 μg/mL），37 ℃反應(yīng)1 h 后用PBS 洗3 次。抗體修飾過程和捕獲CTCs示意圖如圖1所示。

圖1 明膠膜基底捕獲CTCs示意圖Fig.1 Schematic of capturing circulating tumor cells by gelatin film substrate

1.3.2 最佳捕獲時(shí)間向修飾好EpCAM 抗體的6 組明膠膜培養(yǎng)皿基底中分別加入5 000 個(gè)MCF-7，做好標(biāo)記后放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行捕獲。當(dāng)捕獲時(shí)間達(dá)到10、20、30、60、90、120 min 時(shí)，分別拿出對應(yīng)的捕獲裝置，取出上清充分吹懸后，取樣并在顯微鏡下對樣本CTCs 計(jì)數(shù)，最后通過換算得到不同捕獲時(shí)間的效率。

1.3.3 明膠膜基底的捕獲性能分別取500、1 000、5 000、10 000 個(gè)MCF-7 細(xì)胞（取樣步驟大概為：對于500個(gè)和1 000個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞原液稀釋到5 000個(gè)/mL，隨后分別取100 和200 μL 細(xì)胞液；對于5 000 個(gè)和10 000 個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞原液稀釋到10萬個(gè)/mL，分別取50 和100μL 細(xì)胞液）加入到修飾好捕獲抗體的明膠基底上，再用細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）補(bǔ)足0.5 mL，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育60 min 后取出，將上清收集到1.5 mL 離心管中，在顯微鏡下取樣計(jì)算上清中未被捕獲到的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而得知明膠基底上捕獲到的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞的捕獲效率定義為：捕獲效率=基底上捕獲到的細(xì)胞數(shù)/加入的細(xì)胞總數(shù)。

1.3.4 三色熒光鑒定從健康人血中提取白細(xì)胞，取適量白細(xì)胞和MCF-7加入1 mL PBS中，吹勻后加入修飾好EpCAM抗體的捕獲基底共孵育，將捕獲后的基底進(jìn)行三熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察捕獲情況。

1.3.5 捕獲細(xì)胞的活性傳代下來的MCF-7與修飾好EpCAM的捕獲基底共同孵育60 min，然后利用FDA/PI雙染色法染色；用PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。培養(yǎng)的MCF-7也用FDA/PI染色作為對照組。被激發(fā)出綠色熒光的是活細(xì)胞，被激發(fā)出紅色熒光的是死細(xì)胞。細(xì)胞活性定義為活細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比。

1.3.6 細(xì)胞原位培養(yǎng)將基底捕獲到的MCF-7用PBS沖洗2遍，加入1 mL DMEM 完全培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)1、24 和48 h 后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并利用FDA/PI 雙染色法觀察細(xì)胞活性。

2 結(jié)果

2.1 明膠膜基底的表征

圖2 是明膠膜基底的場發(fā)射掃描電鏡圖，對比空白基底，明顯可以看出樣品基底上修飾上了一層膜，即明膠膜。

圖2 明膠膜基底(a)及空白對照(b)場發(fā)射掃描電鏡圖Fig.2 Field emission scanning electron microscopy images of gelatin film substrate(a)and blank control(b)

2.2 最佳捕獲時(shí)間的確定

基底對靶細(xì)胞的孵育時(shí)間會(huì)影響基底對靶細(xì)胞的捕獲效率。為了確定明膠膜基底的最佳捕獲時(shí)間，本研究采用EpCAM 高表達(dá)的MCF-7。捕獲效率隨時(shí)間的變化結(jié)果見圖3，隨著捕獲時(shí)間的延長，捕獲效率在不斷增加，當(dāng)捕獲時(shí)間達(dá)到60 min 左右時(shí)，捕獲效率達(dá)到穩(wěn)定水平。故本研究選擇60 min 作為細(xì)胞孵育的最佳捕獲時(shí)間。

圖3 細(xì)胞捕獲效率Fig.3 Cell capture efficiency

2.3 不同細(xì)胞數(shù)量的捕獲效率

圖4為明膠膜基底對不同數(shù)量MCF-7的捕獲效率圖。明膠膜基底對MCF-7的平均捕獲效率為81.06%，表明修飾有EpCAM的明膠膜基底可以高效捕獲癌細(xì)胞。

圖4 細(xì)胞捕獲效率和細(xì)胞數(shù)目關(guān)系Fig.4 Relationship between cell capture efficiency and cell number

2.4 三色熒光鑒定

本研究主要考慮白細(xì)胞對CTCs捕獲的干擾，采用三色熒光免疫化學(xué)法鑒定CTCs和白細(xì)胞。圖5顯示該捕獲基底可以在大量白細(xì)胞存在時(shí)捕獲到CTCs。

圖5 三色熒光化學(xué)免疫法鑒定細(xì)胞（標(biāo)尺為50 μm）Fig.5 Three-color fluorescence chemical immunoassay for identification of cells (scale bar=50 μm)

2.5 捕獲細(xì)胞的活性

捕獲到的腫瘤細(xì)胞具有高細(xì)胞活性對CTCs 的下游分析具有重要的意義。圖6 分別為活死細(xì)胞染色鑒定捕獲細(xì)胞的活性，從圖中可以看出，明膠膜基底捕獲后的細(xì)胞活性（實(shí)驗(yàn)組）和原始細(xì)胞活性（對照組）幾乎沒有差異，捕獲細(xì)胞和原始細(xì)胞中活細(xì)胞百分比分別為84.29%和86.80%，表明明膠膜捕獲基底具有良好的生物相容性，對后續(xù)的細(xì)胞研究和培養(yǎng)具有重要意義。

圖6 捕獲細(xì)胞活性圖Fig.6 Cytoactive of the captured cells

2.6 細(xì)胞原位培養(yǎng)

圖7 為基底捕獲細(xì)胞后分別進(jìn)行1、24 和48 h的再培養(yǎng)，對細(xì)胞進(jìn)行活死細(xì)胞染色后在熒光顯微鏡下觀察CTCs 的生長狀態(tài)?？梢钥闯雒髂z膜基底捕獲到細(xì)胞后，細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的活性，且隨著時(shí)間的增長，細(xì)胞貼壁開始分裂生長，生長狀態(tài)良好。

圖7 細(xì)胞原位培養(yǎng)（標(biāo)尺為100 μm）Fig.7 Cell culture in situ(scale bar=100 μm)

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一個(gè)簡單可行的基底捕獲裝置，基于明膠膜基底接枝上捕獲抗體EpCAM，從而實(shí)現(xiàn)對CTCs 的捕獲。由于明膠具有良好的生物相容性且是細(xì)胞培養(yǎng)的良好材料，捕獲后的細(xì)胞具有良好的活性，可直接在原位進(jìn)行再培養(yǎng)，減少了釋放過程對細(xì)胞的損害?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，明膠膜基底捕獲裝置在臨床CTCs檢測中具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。