葉曉倩， 劉瑞曦， 馮金慧， 鄧仕明， 李吉濤， 鄧志軍

(1. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北民族大學(xué)， 湖北 恩施 445000； 2. 恩施州特色植物資源種質(zhì)工程技術(shù)研究中心， 湖北民族大學(xué)， 湖北 恩施 445000； 3. 湖北民族大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院， 湖北 恩施 445000)

種子黏液是由種皮外層細(xì)胞中的高爾基體產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞腔或細(xì)胞壁的一些具有強(qiáng)親水性的酸性(果膠)和中性(阿拉伯糖、纖維素、甘露糖、鼠李糖和木糖)多糖[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，至少37目110科230屬的被子植物的種子具有黏液[3-4]。種子黏液可以促進(jìn)種子成熟和傳播，可以通過保濕并激活種子的修復(fù)機(jī)制來保持種子庫的有效性，可以通過減少氧擴(kuò)散來維持種子休眠，可以通過調(diào)節(jié)水分和氧氣的吸收促進(jìn)種子萌發(fā)，還可以通過直接或間接提供營養(yǎng)促進(jìn)幼苗生長[5]。尤其是在沙漠條件下，種子黏液使很多荒漠植物在干旱少雨條件下能夠及時(shí)快速萌發(fā)成苗[6]。

在自然條件下，種子最終能否萌發(fā)成苗，既取決于種子活力的保持能力，也取決于種子的萌發(fā)抗逆性。目前，已知種子黏液有利于種子傳播與萌發(fā)成苗，特別是有利于種子在干旱等逆境條件下的萌發(fā)成苗，而種子黏液對(duì)種子活力保持的影響，以及種子黏液在種子活力保持與萌發(fā)抗逆性之間的關(guān)系中的作用還尚未明確。對(duì)這方面的研究將有助于進(jìn)一步全面認(rèn)識(shí)種子黏液的生態(tài)意義。

車前(Plantagoasiatica)為車前科(Plantaginaceae)車前屬多年生草本植物，全國廣泛分布[7]。車前種子及全草皆可入藥[8]，且在園林綠化中也有廣闊應(yīng)用前景[9]。車前和同屬的小車前(P.minuta)[10]、長葉車前(P.lanceolata)[11]、平車前(P.depressa)[12]、鹽生車前(P.maritimasubsp.Ciliata)[13]和北美車前(P.virginica)[14]的種子表面均具有黏液，這似乎是車前屬植物的共有特征。目前已知，北美車前[14]和小車前[15]種子的黏液均有利于其在干旱環(huán)境下萌發(fā)成苗，而種子黏液對(duì)車前種子萌發(fā)抗逆性和活力保持的影響則未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

車前種子于2018年6月采自湖北省鶴峰縣木林子國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。采回的種子在室溫下陰干一周，測定含水量((8.36±0.02)%)后裝入聚乙烯密封袋并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 種子黏液去除

將種子平鋪在用蒸餾水充分濕潤的雙層濾紙上，在10℃黑暗條件下培養(yǎng)4 h，使種子表面黏液物質(zhì)充分吸水軟化，然后將吸脹后的種子裹在四層醫(yī)用紗布間用手輕輕揉搓以使黏液物質(zhì)與種子充分分離，再通過蒸餾水清洗去除黏液，最后平鋪在干燥濾紙上于10℃黑暗條件下陰干，直至含水量降至與初始含水量相近水平。

1.3 人工加速老化處理

參照Liu等[16]的方法將保留和去除黏液的車前種子分別置于40℃和100%相對(duì)濕度下進(jìn)行人工加速老化處理。在老化處理0，2，4，6，8，10，12，14，16，18 d后取樣，并在指定的最適溫度下進(jìn)行萌發(fā)測試。

1.4 模擬干旱處理

參照Michael和Kaufaman[17]的方法，配制水勢分別為0，-3，-4，-5，-7，-8，-9，-10 MPa的PEG-6000溶液來模擬不同程度的干旱條件，然后用這些不同水勢的PEG-6000溶液在指定的最適溫度下同步培養(yǎng)保留和去除黏液的車前種子。

1.5 模擬鹽脅迫處理

用0，50，75，100，125，150，175，200 mmol·L-1的NaCl溶液來模擬不同程度的鹽脅迫條件，然后用這些不同濃度的NaC l溶液在指定的最適溫度下培養(yǎng)保留和去除黏液的車前種子。

1.6 萌發(fā)測試

新采收的種子分別在5,10,15,20,25,30,35,40℃恒溫，以及15℃/25℃和20℃/30℃變溫(每天低溫和高溫各12 h)和交替光照(12 h黑暗/12 h光照，光照強(qiáng)度為121 μmol·m-2·s-1，變溫條件下的低溫與高溫時(shí)間段分別對(duì)應(yīng)于黑暗與光照時(shí)間段)條件下測試初始萌發(fā)，以選定種子萌發(fā)的最適溫度。

去除黏液和保留黏液種子經(jīng)人工加速老化處理、模擬干旱處理、鹽脅迫處理后在選定的最適恒溫下進(jìn)行萌發(fā)測試。每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)，每次重復(fù)50粒種子，以胚根突破種皮2 mm作為萌發(fā)完成的標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)5 d不再有新增加的萌發(fā)種子后結(jié)束萌發(fā)測試，統(tǒng)計(jì)最終萌發(fā)率。萌發(fā)速率以從培養(yǎng)開始到萌發(fā)率達(dá)最終萌發(fā)率的50%時(shí)所用的時(shí)間(T50)表示，T50值與萌發(fā)速率成反比，即T50值越小，萌發(fā)速率越大。具體計(jì)算方法是，先對(duì)種子累積萌發(fā)率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化進(jìn)行曲線回歸，然后通過回歸方程計(jì)算出T50值。通過下式計(jì)算種子萌發(fā)率：

種子萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計(jì)分析和作圖均使用R軟件(R i386 3.5.2)完成。所有的萌發(fā)率數(shù)據(jù)和T50數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(One-way ANOVA，P=0.05)，并進(jìn)行Student-Newman-Keuls驗(yàn)后多重比較(P=0.05)。文中所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)新鮮成熟車前種子萌發(fā)的影響

如圖1所示，溫度對(duì)新鮮成熟車前種子萌發(fā)具有顯著影響(P<0.05)。車前種子除了在5℃和40℃恒溫條件下無萌發(fā)外，在其他溫度下均有不同數(shù)量的萌發(fā)。在25℃與30℃恒溫及15℃/25℃與20℃/30℃變溫條件下的萌發(fā)率間無顯著差異，均在94%以上，且均顯著高于其他溫度條件下的萌發(fā)率。選定25℃作為人工加速老化處理、模擬干旱處理、鹽脅迫處理后的萌發(fā)測試溫度。

圖1 新鮮成熟車前種子在幾個(gè)恒溫、交替變溫和交替光照條件下的萌發(fā)率

2.2 去除黏液和保留黏液種子萌發(fā)對(duì)人工加速老化的響應(yīng)

隨著老化處理時(shí)間的延長，去除黏液和保留黏液種子的萌發(fā)率(圖2A)和萌發(fā)速率(圖2B，萌發(fā)速率與T50值成反比)均呈逐漸下降趨勢，保留黏液種子老化8 d后萌發(fā)率即顯著下降，而去除黏液種子則直到老化12 d后萌發(fā)率才發(fā)生顯著下降，兩種種子均在老化18 d后幾乎不再有種子萌發(fā)(圖2A)。經(jīng)6 d的老化處理后，去除黏液和保留黏液種子的萌發(fā)率無顯著差異(圖2A)，但去除黏液種子的萌發(fā)速率卻顯著高于保留黏液種子(P<0.05，圖2B)；經(jīng)10 d和12 d的老化處理后，去除黏液種子的萌發(fā)率和萌發(fā)速率均顯著高于保留黏液種子(P<0.05，圖2A，B)；經(jīng)14 d的老化處理后，去除黏液種子的萌發(fā)率顯著高于保留黏液種子(P<0.05，圖2A)，但兩者的萌發(fā)速率間卻無顯著差異(圖2B)；對(duì)于其他老化處理，兩種種子在萌發(fā)率和萌發(fā)速率方面均無顯著差異(圖2A，B)。

圖2 車前種子的萌發(fā)率(A)和萌發(fā)速率(B)隨人工加速老化處理的變化

2.3 去除黏液和保留黏液種子萌發(fā)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

隨著PEG-6000溶液水勢的降低(即干旱脅迫增強(qiáng))，不管種子有無黏液，車前種子的萌發(fā)率(圖3A)和萌發(fā)速率(圖3B)均呈下降趨勢。所不同的是，保留黏液種子的萌發(fā)率在水勢降至-5 MPa時(shí)開始顯著下降，隨后則相對(duì)緩慢地下降；而去除黏液種子萌發(fā)率則當(dāng)水勢降至-7 MPa時(shí)才顯著下降，但隨后卻相對(duì)更加快速地下降，當(dāng)水勢小于等于-9 MPa時(shí)均不再有種子萌發(fā)(圖3A)。在-5 MPa水勢條件下去除黏液種子的萌發(fā)率顯著高于保留黏液種子(P<0.05)，而在-7 MPa水勢條件下保留黏液種子的萌發(fā)率則顯著高于去除黏液種子(P<0.05)，在其他水勢條件下兩者的萌發(fā)率均無顯著差異(圖3A)；而從萌發(fā)速率來看，除了在-8 MPa水勢條件下保留黏液種子的萌發(fā)速率顯著高于去除黏液種子外(P<0.05)，在其他水勢條件下兩者均無顯著差異(圖3B)。

圖3 車前種子萌發(fā)率(A)和萌發(fā)速率(B)隨干旱脅迫處理的變化

2.4 去除黏液和保留黏液種子萌發(fā)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

隨著NaCl溶液濃度的升高(鹽脅迫增強(qiáng))，去除黏液和保留黏液種子的萌發(fā)率(圖4A)和萌發(fā)速率(圖4B)均具有相似的變化趨勢。均當(dāng)NaCl溶液濃度升高至175 mmol·L-1的時(shí)候，萌發(fā)率才急劇下降，而當(dāng)NaCl溶液濃度升高至200 mmol·L-1時(shí)種子均幾乎不再萌發(fā)(圖4A)。從萌發(fā)速率來看，僅在75 mmol·L-1的NaCl溶液培養(yǎng)下保留黏液種子的萌發(fā)率速率顯著高于去除黏液種子(P<0.05)，其余各濃度NaCl溶液處理下兩種種子的萌發(fā)速率均無顯著差異(圖4B)。

圖4 車前種子萌發(fā)率(A)和萌發(fā)速率(B)隨鹽脅迫處理的變化

3 討論

種子劣變是一種自然現(xiàn)象，同時(shí)受到自身遺傳因素和外界環(huán)境條件的影響。本研究通過人工老化處理模擬自然劣變，從而探討種子黏液對(duì)種子活力保持的作用。結(jié)果顯示，隨著老化程度的加深，去除黏液種子的萌發(fā)速率和萌發(fā)率幾乎均高于保留黏液種子，說明黏液物質(zhì)的存在不利于種子生活力的保持。已有的研究表明，保留黏液種子的吸水量顯著高于去除黏液種子的吸水量[14-15]。因此，在人工老化(高溫高濕)條件下，保留黏液的車前種子的吸水量肯定高于去除黏液種子，使保留黏液種子的呼吸作用更強(qiáng)，從而加速種子內(nèi)貯藏物質(zhì)的消耗，最終導(dǎo)致生活力喪失。同時(shí)，呼吸作用的增強(qiáng)會(huì)放出更多的熱量，進(jìn)而導(dǎo)致種子表面及種子間的微生物活動(dòng)增強(qiáng)，從而產(chǎn)生更多的熱量，最終致使種子發(fā)霉變質(zhì)。

對(duì)于干旱環(huán)境下的種子而言，水分是其萌發(fā)成苗的決定因子[18]。種子黏液可通過調(diào)節(jié)水分吸收來調(diào)控種子萌發(fā)，以適應(yīng)多變的水分環(huán)境，從而增強(qiáng)種子的抗旱性[5]。伍晨曦等[15]發(fā)現(xiàn)，在低滲透脅迫(-0.33～-0.15 MPa)下，小車前保留黏液種子的發(fā)芽勢和萌發(fā)率均顯著高于去除黏液種子；而在高滲透脅迫(-1.15～-0.73 MPa)下，種子黏液的有無對(duì)種子萌發(fā)率無顯著影響。羅輝等[14]則發(fā)現(xiàn)，僅在高滲透脅迫(-1.21～-0.58 MPa)下，保留黏液的北美車前種子的萌發(fā)率顯著高于去除黏液種子。但在本研究中，隨著滲透脅迫的加劇，種子黏液對(duì)于車前種子萌發(fā)抗旱性的影響，在萌發(fā)率和萌發(fā)速率兩個(gè)方面具有不同的表現(xiàn)，在-4～0 MPa水勢條件下，兩種種子在萌發(fā)率和萌發(fā)速率上均無顯著差異；在相對(duì)較低滲透脅迫(-5 MPa)下時(shí)，保留黏液種子的萌發(fā)率顯著低于去除黏液種子；在相對(duì)中等水平的滲透脅迫(-7 MPa)下時(shí)，保留黏液種子的萌發(fā)率顯著高于去除黏液種子；而在相對(duì)較高滲透脅迫(-8 MPa)下時(shí)，兩種種子的萌發(fā)率無顯著差異，只是保留黏液種子的萌發(fā)速率顯著高于去除黏液種子。由此可以推斷，萌發(fā)速率比萌發(fā)率對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)更為敏感，種子黏液在較低滲透脅迫下似乎阻礙種子萌發(fā)，僅在較高滲透脅迫下才表現(xiàn)出促進(jìn)萌發(fā)的作用。

種子萌發(fā)期對(duì)鹽敏感，鹽脅迫會(huì)抑制種子萌發(fā)[19]。車前種子[20]、小車前種子[21]的萌發(fā)率均隨著鹽溶液濃度的升高而降低。在本研究中，車前種子的萌發(fā)率隨著鹽濃度的升高大致呈下降趨勢，直至幾乎不能萌發(fā)。從萌發(fā)率來看，在相同鹽濃度下保留或去除黏液對(duì)車前種子的萌發(fā)率沒有顯著影響，從萌發(fā)速率來看，僅在75 mmol·L-1的NaCl溶液培養(yǎng)下保留黏液種子的萌發(fā)速率顯著高于去除黏液種子。由此可見，從對(duì)萌發(fā)速率的影響來看，車前種子黏液可增強(qiáng)種子對(duì)輕微鹽脅迫的萌發(fā)抗性。鹽脅迫對(duì)植物的危害常表現(xiàn)為水分脅迫，外界與細(xì)胞間不當(dāng)?shù)臐B透勢差迫使細(xì)胞失水，嚴(yán)重時(shí)甚至發(fā)生質(zhì)壁分離、細(xì)胞死亡等現(xiàn)象[22]。種子黏液通過調(diào)節(jié)水分，消除不當(dāng)滲透差，防止種子過度失水，從而達(dá)到減緩鹽害的目的[23]?？梢钥闯觯嚽胺N子的黏液對(duì)于種子在干旱和鹽脅迫下的萌發(fā)具有一定的調(diào)節(jié)作用，在較低程度的干旱和鹽脅迫條件下，黏液物質(zhì)的存在保證種子表面有足夠的有效水分，減緩了干旱和鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的不利影響，從而保障了種子正常吸水萌發(fā)。

4 結(jié)論

車前種子黏液物質(zhì)的存在，一方面，不利于種子活力的保持，加速其老化，而另一方面，又在一定程度上提高了種子對(duì)輕微干旱脅迫和鹽脅迫的抗性。