郝曉華,高如霞,宿 婧,羅淑政

(忻州師范學(xué)院 生物系，山西，忻州 034300)

薄荷，其莖直立，又稱水薄荷、蕃荷葉、魚香草、夜息花等，全株散發(fā)濃郁的清涼香味，其地上部分為傳統(tǒng)中藥成分[1].薄荷對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較寬，開(kāi)始萌發(fā)于初春時(shí)節(jié)，生長(zhǎng)最適宜溫度為25 ℃左右，在冬季亦可正常生長(zhǎng)[2].因此常生長(zhǎng)在北部的溫帶地區(qū)，在我國(guó)南部各省也均有分布[3].薄荷的化學(xué)成分主要有有機(jī)酸、黃酮類化合物、薄荷精油等[4-6].

脅迫，又稱逆境，是指不適宜植物生長(zhǎng)的環(huán)境條件，如寒冷、炎熱、干旱、鹽漬等.這些逆境常使植物在外在形態(tài)和內(nèi)在生理生化等水平上發(fā)生不同程度的變化.雖然脅迫是暫時(shí)的，但植物活力與脅迫時(shí)間呈負(fù)相關(guān).植物的自身調(diào)節(jié)能力也存在上限，當(dāng)惡劣的環(huán)境條件超過(guò)其自身調(diào)節(jié)能力上限時(shí)，則發(fā)展成的傷害呈不可逆性甚至?xí)?dǎo)致植物體死亡[7].因此，關(guān)于植物在不同環(huán)境脅迫下的適應(yīng)能力和抗性研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.

低溫脅迫作為環(huán)境脅迫的一種典型因素，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程有重要的影響.低溫脅迫的意思是培養(yǎng)植物體的溫度低于植物能正常生長(zhǎng)的最適溫度，包括零上低溫寒害和零下低溫凍害兩種影響[8].

由于山西省地理位置特殊，且氣候?yàn)榇箨懶约撅L(fēng)氣候，因此，山西省的低溫環(huán)境對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖產(chǎn)生一定的影響[9].本研究通過(guò)對(duì)低溫脅迫下的薄荷幼苗施加外源水楊酸(SA)的方法，研究外源SA對(duì)于薄荷幼苗抗寒性的影響，對(duì)薄荷的種植具有指導(dǎo)意義.

目前關(guān)于薄荷的研究主要為藥理研究，薄荷芳香成分分析及精油的提取，薄荷的栽培、采收及繁殖技術(shù)，以及薄荷的病蟲害防治技術(shù)等方面.對(duì)于低溫脅迫的研究較多，例如棉花，玉米，秋茄，黃瓜等，研究?jī)?nèi)容包括低溫脅迫對(duì)種子的萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，比較同種植物不同品種間的抗寒性大小，以及如何有效地提高植物對(duì)低溫脅迫的抗性.目前提高農(nóng)作物抗寒性的方法主要是藥劑的使用[10]，如SA.內(nèi)源信號(hào)物質(zhì)[11]可以調(diào)節(jié)植物大部分的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，SA廣泛存在于植物體內(nèi)，作為一種植物激素(其是一種小分子酚類化合物)，它可在植物的抗寒、抗旱、鹽脅迫、重金屬脅迫等非生物脅迫方面起著重要的調(diào)節(jié)作用.除SA外，多胺(PAs)、鈣離子(Ga2+)、一氧化氮(NO)等都可以提高植物的抗逆性[12].但目前外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下薄荷幼苗的生理影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理方法

1.1.1 材料選擇及處理

所用材料為相同培養(yǎng)條件下健壯的檸檬薄荷幼苗，購(gòu)于忻州萬(wàn)菁花卉市場(chǎng)，前期時(shí)加入Hongland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)時(shí)采用盆栽試驗(yàn)，每盆保留幼苗3株，設(shè)置2個(gè)重復(fù).

1.1.2 SA不同濃度及低溫處理

薄荷幼苗培養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)行水楊酸葉片噴施處理和低溫處理，實(shí)驗(yàn)在忻州師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)室305進(jìn)行.先噴施水楊酸進(jìn)行預(yù)處理.將幼苗在實(shí)驗(yàn)室自然低溫(平均日溫14 ℃，夜溫11 ℃)脅迫下分別以濃度為50 mg/L 、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L和250 mg/L的SA噴施薄荷幼苗的地上部分，噴至葉面上水珠快要滴落下來(lái)為止(實(shí)際噴施大約6 mL/盆，即可達(dá)到此效果)，1 d噴一次，共噴施7 d，同時(shí)以實(shí)驗(yàn)室自然低溫下加蒸餾水為低溫對(duì)照，正常室溫(平均日溫22 ℃，夜溫18 ℃)下加蒸餾水為常溫對(duì)照.然后將幼苗放置實(shí)驗(yàn)室自然生長(zhǎng)7 d后，取莖葉測(cè)定各項(xiàng)生理生態(tài)指標(biāo)，期間每天給幼苗澆少量營(yíng)養(yǎng)液和水.

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

數(shù)顯恒溫水浴鍋；萬(wàn)分之一電子天平；低速離心機(jī)；紫外分光光度計(jì)；冰箱.

硫代巴比妥酸；茚三酮；水楊酸；脯氨酸；考馬斯亮藍(lán)G-250；愈創(chuàng)木酚；氮藍(lán)四唑.以上試劑均為分析純.

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

幼苗根基部到生長(zhǎng)點(diǎn)之間的高度指株高，多次測(cè)量薄荷的株高，最后求平均值；依次測(cè)量幼苗鮮重以及地上部和地下部干重：首先洗凈幼苗表面的雜土，接著使用蒸餾水將幼苗沖洗干凈，然后吸干幼苗水分測(cè)量其鮮重，最后在80 ℃的條件下烘干測(cè)定恒重.幼苗地下部的干重與地上部的干重之比稱為根冠比；絕對(duì)含水量是指幼苗的鮮重與干重之差占干重的百分比.

1.3.2 膜脂過(guò)氧化程度測(cè)定

測(cè)定丙二醛(MDA)的含量：參考其他科研工作者的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方法，采用的測(cè)定方法為硫代巴比妥酸(TBA)比色法[13]，與此同時(shí)，測(cè)定出可溶性糖的含量，采用的方法為分光光度計(jì)法[13].

1.3.3 抗氧化酶活性測(cè)定

a.測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性：參考并使用氮藍(lán)四唑(NBT)法[14].

b.測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性：參考并使用愈創(chuàng)木酚法[15].

c.測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活力：參考并使用紫外吸收法[16].

1.3.4 抗氧化劑含量測(cè)定

a.測(cè)定脯氨酸含量：參考并使用酸性茚三酮法[17].

b.測(cè)定可溶性蛋白含量：Brandford(考馬斯亮藍(lán)G-250染色)法[15].

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0進(jìn)行顯著性分析，用Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)薄荷幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

由表1可知，除常溫對(duì)照外，低溫脅迫下，薄荷幼苗的株高、鮮重、干重、根冠比和絕對(duì)含水量都有所下降，且除干重和株高差異不顯著外，其余指標(biāo)都差異較顯著.低溫脅迫與低溫對(duì)照相比，隨著SA濃度的增加，薄荷幼苗的株高、鮮重、干重等指標(biāo)都隨著增加.當(dāng)SA濃度達(dá)到150 mg/L時(shí)，薄荷幼苗的株高達(dá)到最大.當(dāng)SA濃度繼續(xù)上升到200 mg/L時(shí)，薄荷幼苗的鮮重、干重、根冠比和絕對(duì)含水量此時(shí)都為最大值.當(dāng)繼續(xù)增加SA濃度時(shí)，幼苗的相應(yīng)指標(biāo)值都開(kāi)始下降，此時(shí)幼苗的株高指標(biāo)與其他濃度下相比差異顯著.

表1 低溫脅迫對(duì)薄荷幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

為了體現(xiàn)不同處理的顯著差異使用不同小寫字母；不顯著的差異則使用同一列數(shù)據(jù)間字母相同來(lái)體現(xiàn)(P< 0.05).

2.2 薄荷幼苗膜脂過(guò)氧化程度受低溫脅迫的影響

由圖1可知，對(duì)照常溫實(shí)驗(yàn)組，低溫脅迫的條件下，隨著SA濃度的增加，薄荷幼苗的MDA含量是先減少后增加，其中效果最顯著時(shí)SA的濃度為100 mg/L.比較低溫脅迫和低溫對(duì)照時(shí)薄荷幼苗的MDA含量，結(jié)果均低于對(duì)照，且差異顯著.而低濃度SA處理(50～100 mg/L)MDA含量降低幅度較大，高濃度SA處理(150～250 mg/L)MDA含量降低的幅度較小.低溫對(duì)照較常溫對(duì)照相比，低溫對(duì)照MDA含量較常溫對(duì)照高，低溫對(duì)照與常溫對(duì)照差異顯著.

圖1 不同濃度SA處理對(duì)幼苗MDA含量的影響

2.3 薄荷幼苗抗氧化酶活性受低溫脅迫的影響

2.3.1 SA處理對(duì)薄荷幼苗SOD活性的影響

由圖2可知，低溫條件下，SA葉片噴施處理提高了薄荷幼苗的SOD活性，其中150 mg/LSA處理時(shí)效果最好.隨著SA濃度的增加，SOD活性也逐漸增加，在達(dá)到150 mg/L時(shí)，當(dāng)SA濃度進(jìn)一步增大時(shí)，SOD活性下降.低溫脅迫與低溫對(duì)照相比，低溫對(duì)照均小于各個(gè)SA濃度處理組，而且它們的差異十分大.SOD活性增加幅度受低濃度SA處理(50～150 mg/L)的影響比較大，SOD活性變化范圍受高濃度SA處理(200～250 mg/L)的影響比較小.低溫對(duì)照較常溫對(duì)照相比，低溫對(duì)照SOD活性較常溫對(duì)照高，低溫對(duì)照與常溫對(duì)照差異顯著.

圖2 不同濃度SA處理對(duì)幼苗SOD活性的影響

2.3.2 SA處理對(duì)薄荷幼苗POD活性的影響

由圖3可知，與常溫對(duì)照相比，低溫脅迫下薄荷幼苗SA葉片噴施處理使幼苗的POD活性提高，POD活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中100 mg/LSA處理時(shí)效果最好.在低溫的條件下，當(dāng)SA濃度增加時(shí)，POD活性也隨之加大，在達(dá)到100 mg/L時(shí)，再增大SA濃度時(shí)，POD活性增加會(huì)呈下降趨勢(shì)，在達(dá)到250 mg/L時(shí)，POD活性低于低溫對(duì)照，說(shuō)明250 mg/L的SA處理抑制了POD酶的活性.低溫脅迫時(shí)，無(wú)論是在低濃度的SA處理(50～100 mg/L)下，還是在高濃度的SA處理(150～200 mg/L)下，POD活性的變化幅度都比較大.低溫對(duì)照較常溫對(duì)照相比，低溫對(duì)照POD活性較常溫對(duì)照高，低溫對(duì)照和常溫對(duì)照相比，兩者的差別并不大.

圖3 幼苗POD活性受不同濃度SA處理的影響

2.3.3 SA處理對(duì)薄荷幼苗CAT活性的影響

由圖4可知，薄荷幼苗隨著SA濃度的增加，CAT活性變化是先快速下降后緩慢上升，可以得出SA的濃度為100 mg/L時(shí)處理的效果是最好的.在低溫脅迫下，當(dāng)SA濃度上升時(shí)，CAT活性則下降，在達(dá)到100 mg/L時(shí)，當(dāng)SA濃度進(jìn)一步增大時(shí)，CAT活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而且比低溫對(duì)照組高，這說(shuō)明低濃度的SA處理(50～100 mg/L)抑制了CAT酶的活性，高濃度的SA處理(150～250 mg/L)使CAT酶的活性增加.當(dāng)SA濃度達(dá)到250 mg/L時(shí)，CAT酶的活性甚至高于常溫對(duì)照.低溫對(duì)照較常溫對(duì)照相比，低溫對(duì)照CAT活性較常溫對(duì)照低，低溫對(duì)照與常溫對(duì)照差異顯著.

圖4 不同濃度SA處理對(duì)幼苗CAT活性的影響

2.4 低溫脅迫對(duì)薄荷幼苗Pro、可溶性蛋白、可溶性糖變化的影響

2.4.1 SA處理對(duì)薄荷幼苗Pro含量的影響

由圖5可知，在低溫的條件下，薄荷幼苗SA葉片噴施處理提高了薄荷幼苗的Pro含量，當(dāng)SA的濃度上升時(shí)，薄荷幼苗中Pro的含量變化是先快速上升后緩慢下降，其中150 mg/LSA處理時(shí)Pro含量達(dá)到最大.低溫脅迫時(shí)，各SA處理蛋白質(zhì)濃度均大于低溫對(duì)照，低濃度的SA處理(50～150 mg/L)Pro含量增加變化較明顯，高濃度的SA處理(200～250 mg/L)Pro含量變化不明顯.低溫對(duì)照較常溫對(duì)照相比，低溫對(duì)照Pro含量較常溫對(duì)照高，且低溫對(duì)照與常溫對(duì)照差異顯著.

圖5 不同濃度SA處理對(duì)幼苗Pro含量的影響

2.4.2 薄荷幼苗可溶性蛋白含量受SA處理的影響

由圖6可知，低溫條件下，薄荷幼苗的可溶性蛋白含量被SA葉片噴施處理這種方式提高了,其中150 mg/L的SA處理效果最顯著.當(dāng)SA濃度增加時(shí)，可溶性蛋白含量也隨之增加，先逐漸上升，在達(dá)到150 mg/L時(shí)，繼續(xù)加大SA濃度，則呈現(xiàn)下降趨勢(shì).與低溫對(duì)照相比，低溫脅迫下的可溶性蛋白含量均比低溫對(duì)照大，而且它們差別明顯.低溫對(duì)照較常溫對(duì)照相比，低溫對(duì)照可溶性蛋白含量較常溫對(duì)照高，低溫對(duì)照與常溫對(duì)照差別明顯.

圖6 不同濃度SA處理對(duì)幼苗可溶性蛋白含量的影響

2.4.3 SA處理對(duì)薄荷幼苗可溶性糖含量的影響

由圖7可知，隨著SA濃度的增加，薄荷幼苗中可溶性糖的含量呈現(xiàn)下降后上升的趨勢(shì)，但變化幅度較小.其中150 mg/L的SA處理效果最顯著.低溫脅迫時(shí)，各SA處理濃度均低于低溫對(duì)照，低濃度SA處理(50～150 mg/L)和高濃度SA處理(200～250 mg/L)可溶性糖的含量下降和上升的幅度相差較小.低溫對(duì)照較常溫對(duì)照相比，低溫對(duì)照可溶性糖的含量較常溫對(duì)照高，低溫對(duì)照與常溫對(duì)照差異顯著.

圖7 不同濃度SA處理對(duì)幼苗POD活性的影響

3 結(jié)論

結(jié)果表明，低溫脅迫下，100 mg/L～200 mg/L的SA噴施薄荷葉片處理效果最顯著，低于或高于此濃度都起不到很好的效果，即外源水楊酸噴施薄荷葉片處理具有雙重效應(yīng)：低濃度的SA處理可以通過(guò)調(diào)節(jié)各種抗氧化酶活性和抗氧化劑，抑制膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性，高濃度的SA處理則使得提高抗寒性的效果較低，可能的機(jī)制是水楊酸作為一種植物激素與生長(zhǎng)素的作用機(jī)制相似，即低濃度的SA能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，高濃度則抑制植物生長(zhǎng).研究中所設(shè)置的SA濃度0、50、100、150、200和250 mg/L均可以對(duì)低溫脅迫下的薄荷幼苗的抗寒性起到輔助作用，提高薄荷幼苗的抗寒性.但是，SA介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑與植物抗逆性的關(guān)系，各研究者在不同的實(shí)驗(yàn)材料中的研究結(jié)論也不盡相同.雖然關(guān)于SA對(duì)植物抗逆性的研究很多，但想要完全明確SA在輔助植物的各種抗性中的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究.