孫萌，董薈慧，趙雅津

（1 大連海關(guān)技術(shù)中心，遼寧大連 116001；2 大連海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116001）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

供試土壤樣本：大連市荒地土壤；體式顯微鏡：ZEISS AXIO ZOOM V1.6；光學(xué)顯微鏡：ZEISS Discovery；線蟲(chóng)快速分離器：自制。

1.2 方法

1.2.1 線蟲(chóng)快速分離裝置原理。正壓式線蟲(chóng)快速分離裝置是由大連海關(guān)技術(shù)中心設(shè)計(jì)和研發(fā)的一款新型植物線蟲(chóng)快速分離裝置，目前，已向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局申請(qǐng)實(shí)用新型專利，申請(qǐng)?zhí)枮?02021899804.7。其工作原理是采用正向壓力，使水流攜帶土壤快速穿過(guò)由不同孔徑的篩網(wǎng)組成的快速富集系統(tǒng)，篩去大部分土壤內(nèi)的植物組織、土壤顆粒、雜質(zhì)，達(dá)到線蟲(chóng)與土壤分離的目的。

壓差法植物線蟲(chóng)快速富集裝置，包括密封筒體、氣泵、漏斗篩網(wǎng)系統(tǒng)、進(jìn)排水系統(tǒng)。密封筒體上連接用于測(cè)量用的壓力表，氣泵連接至密封筒體內(nèi)，漏斗篩網(wǎng)系統(tǒng)連接于密封筒體下方，包括多層目數(shù)不等的套篩，且套篩的目數(shù)從上至下層依次增加。進(jìn)排水系統(tǒng)包括連接于密封筒體上的出水口與入水口，還包括連接于漏斗篩網(wǎng)系統(tǒng)下方的排水閥。

本裝置使用時(shí)，先將要處理的樣品放入密封筒體內(nèi)，將土壤樣品盡量攪拌均勻。封閉艙門，向筒體內(nèi)注水，當(dāng)水面達(dá)到一定高度時(shí)停止，封閉排氣閥，打開(kāi)氣泵增壓，當(dāng)壓力達(dá)到一定值時(shí)停止。打開(kāi)最下端排水閥，待壓力表3 回零后，拆下最下層篩網(wǎng)，沖洗并收集下層篩網(wǎng)中的物質(zhì)，即可得到線蟲(chóng)懸浮液。

1.2.2 線蟲(chóng)快速分離器分離土壤樣本方法。選取植被茂盛的潮濕土壤，將植物表面部分用鋤頭除去后，疏松土壤表面，挖至下層2～3cm 處。鏟取松動(dòng)的土壤，將其密封在密封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆?。取上述土?0g 至于燒杯中，向燒杯內(nèi)注水400mL，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝箪o置20s，將上浮液緩慢倒入線蟲(chóng)分離器密封筒體內(nèi)。蓋上桶蓋、密封把手，關(guān)閉排氣閥、入水口、出水口，按下綠色按鈕，氣泵開(kāi)始向密封筒體內(nèi)加壓，觀察壓力表，當(dāng)壓力達(dá)到一定量時(shí)，按紅色按鈕停止加壓。打開(kāi)底部排水閥，待水完全排干后，打開(kāi)排氣閥，桶內(nèi)氣體完全排空后，取下漏斗及篩網(wǎng)，收集底部1～2 層篩網(wǎng)上的物質(zhì)得到線蟲(chóng)懸浮液，對(duì)其進(jìn)行鏡檢并計(jì)數(shù)。

1.2.3 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)。為研究線蟲(chóng)快速分離裝置可控因子，對(duì)線蟲(chóng)分離效果的影響及因子間的相互作用進(jìn)行分析，根據(jù)裝置設(shè)計(jì)，采用2 因子2 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。裝置工作時(shí)的篩網(wǎng)組合V1和最大壓力差V2為2 個(gè)可變因子，每個(gè)因子分別設(shè)計(jì)低、高2 個(gè)水平，每個(gè)因子的組合進(jìn)行3 組重復(fù)試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。使用Minitab 軟件，對(duì)因子水平進(jìn)行完全隨機(jī)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即隨機(jī)對(duì)每種水平、每個(gè)因子的試驗(yàn)按順序安排，以規(guī)避裝置重復(fù)或規(guī)律性地進(jìn)行一種水平試驗(yàn)帶來(lái)的誤差。

表1 因子水平設(shè)計(jì)

1.2.4 線蟲(chóng)分離效果評(píng)價(jià)。線蟲(chóng)計(jì)數(shù)方法：將線蟲(chóng)分離液倒入大號(hào)培養(yǎng)皿中，在立體顯微鏡下進(jìn)行觀察。取6倍目鏡與10 倍物鏡組合的1 個(gè)視野作為計(jì)數(shù)單位，共計(jì)數(shù)5 個(gè)視野。設(shè)1 個(gè)視野在整個(gè)培養(yǎng)皿中的占比為X，5 個(gè)視野中線蟲(chóng)的數(shù)量分別為Ni，用于分離的土壤用量為m，則1g 土壤中分離得到的線蟲(chóng)數(shù)量n 通過(guò)下式可得：

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

按照1.2.3 中的順序進(jìn)行試驗(yàn)，得到試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）。

表2 各因子水平組合試驗(yàn)結(jié)果

用minitab 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果（見(jiàn)表3）。

表3 方差分析表

2.2 結(jié)果分析

取置信水平α=0.05，通過(guò)分析結(jié)果可得：（1）模型適用程度的P 值＜0.05，結(jié)果十分顯著，說(shuō)明使用此方法估計(jì)正壓式線蟲(chóng)快速富集裝置，對(duì)土壤線蟲(chóng)的分離效果有利。（2）因子V1（篩網(wǎng)組合）對(duì)結(jié)果影響不顯著，既篩網(wǎng)組合方式并不直接影響裝置對(duì)土壤線蟲(chóng)的分離效率。（3）因子V2（工作壓力差）對(duì)結(jié)果影響顯著，也就是說(shuō)，采用的壓力差很大程度上會(huì)影響裝置對(duì)土壤線蟲(chóng)的分離效率。（4）2 因子的交互作用對(duì)結(jié)果影響十分顯著，表明該裝置在不同孔徑的篩網(wǎng)組合下，壓力差對(duì)線蟲(chóng)分離效率的影響可能呈現(xiàn)完全不同的趨勢(shì)。

3 結(jié)論及討論

通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知，在采用較粗糙的篩網(wǎng)組合（100目—200 目—200 目—500 目）時(shí)，裝置的線蟲(chóng)分離率隨著壓力差的增加而增加。但在采用較細(xì)密的篩網(wǎng)組合（100 目—200 目—400 目—500 目）時(shí)，裝置線蟲(chóng)分離率隨著壓力的升高反而下降。如采用第一種篩網(wǎng)組合，0.06Map 壓力差時(shí)，裝置的分離效率達(dá)到最高。一般認(rèn)為，400 目、500 目標(biāo)準(zhǔn)篩網(wǎng)是線蟲(chóng)無(wú)法通過(guò)的孔徑，此篩網(wǎng)上即可收集到線蟲(chóng)。而具有400、500 目篩網(wǎng)的篩網(wǎng)系統(tǒng)中，線蟲(chóng)分離效率隨壓力升高而降低，主要原因可能是由于使用較細(xì)密的篩網(wǎng)（100 目—200 目—400目—500 目）。當(dāng)壓力升高時(shí)，會(huì)使土壤顆粒和膠體迅速封堵住400 目的篩網(wǎng)，使其通透性大大降低，從而使整個(gè)篩網(wǎng)系統(tǒng)分離效率下降。最下層的500 目篩網(wǎng)不會(huì)大量富集線蟲(chóng)，因此，導(dǎo)致分離效率下降。使用較粗的篩網(wǎng)（100 目—200 目—200 目—500 目），更高的壓力會(huì)使水流更快速地穿過(guò)篩網(wǎng)，使土壤中的線蟲(chóng)更徹底地被沖洗出來(lái)。因此，在使用此裝置分離土壤線蟲(chóng)時(shí)，首先應(yīng)避免使用過(guò)于細(xì)密的篩網(wǎng)組合，其次提高壓力差，以獲得更高的線蟲(chóng)分離效率。

綜上所述，研究表明，采用正壓式線蟲(chóng)快速富集裝置，快速分離和收集土壤中的活體線蟲(chóng)有效、用時(shí)較短且容易觀察。通常采用傳統(tǒng)的貝爾曼漏斗法，平均分離時(shí)間為16～24h；采用過(guò)篩法，雖然時(shí)間可以縮短至1h，但分離出的線蟲(chóng)懸浮液通常含有大量土壤雜質(zhì)或膠體，嚴(yán)重影響線蟲(chóng)的觀察和種類鑒定。采用正壓式線蟲(chóng)快速富集裝置，分離時(shí)間為20～30min，縮短了線蟲(chóng)分離所需時(shí)間，且分離出的線蟲(chóng)懸浮液中雜質(zhì)和土壤膠體的含量較過(guò)篩法少，平衡了分離時(shí)間和雜質(zhì)干擾的問(wèn)題。

不同的線蟲(chóng)分離法，對(duì)各種類群的線蟲(chóng)和不同體型的線蟲(chóng)分離效果存在差異。貝爾曼漏斗法由于其原理是依靠線蟲(chóng)的活性和趨水性，分離出的線蟲(chóng)以活體線蟲(chóng)為主，且對(duì)線蟲(chóng)活性有一定要求，當(dāng)處于線蟲(chóng)不活躍的季節(jié)，分離率會(huì)受到影響。過(guò)篩法可得到死體和活體線蟲(chóng)，由于依靠自然重力通過(guò)篩網(wǎng)。因此，對(duì)篩網(wǎng)孔徑有一定要求，分離出的線蟲(chóng)在體型上有一定局限性。正壓式線蟲(chóng)快速富集裝置由于依靠壓力差進(jìn)行分離，篩網(wǎng)孔徑組合有一定靈活度，在分離出的線蟲(chóng)體型方面較過(guò)篩法范圍更廣，且可以分離出死體和活體線蟲(chóng)。由于分離時(shí)間短，可能導(dǎo)致某些種類，尤其是植物內(nèi)寄生線蟲(chóng)沒(méi)有充分游離出寄主，就和寄主一同被篩網(wǎng)系統(tǒng)擋住。因此，分離得到的線蟲(chóng)種類可能會(huì)有一定局限性，如時(shí)間充裕，可嘗試將土壤樣品浸泡1～2h，使某些種類的線蟲(chóng)更充分地游離出植物組織，以得到種類更為全面的線蟲(chóng)種類。

關(guān)于正壓式線蟲(chóng)快速富集裝置分離線蟲(chóng)的效率與傳統(tǒng)分離方法的對(duì)比及分離得到線蟲(chóng)的種類差異等方面，還需進(jìn)一步詳細(xì)研究，以期該裝置在口岸線蟲(chóng)檢疫和土壤線蟲(chóng)研究工作中得到推廣應(yīng)用。