李穗君，費永濤，鄭 茵，李 理，3*

（1 華南理工大學食品科學與工程學院 廣州 510640 2 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 廣州 510225 3 中新國際聯(lián)合研究院 廣州 510700）

豆腐乳清是豆腐制作過程中產(chǎn)生的黃色瀝水，俗稱豆腐黃漿水，通常每加工處理1 t 大豆產(chǎn)生4～5 t 的豆腐乳清。豆腐乳清含有豐富的低聚糖、蛋白質(zhì)、異黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)，直接排放往往產(chǎn)生很高的BOD 和COD[1]，不僅造成極大的資源浪費，還帶來嚴重的環(huán)境污染。如何對豆腐乳清進行綜合開發(fā)利用，成為國內(nèi)外學者關(guān)注的問題。目前，國內(nèi)外學者對豆腐乳清進行了較多的研究。如利用豆腐乳清來進行醬油和醋的配制[2-3]，利用酵母菌發(fā)酵豆腐乳清制備酒精飲料[4]，利用乳酸菌發(fā)酵豆腐乳清制備飲料[5]。多項研究表明，利用益生菌來發(fā)酵豆腐乳清，其抗氧化活性和生物活性得到明顯的提高[5-7]。本課題組前期從自然發(fā)酵的酸漿水中分離篩選到哈爾濱乳桿菌M1[8]、黏膜乳桿菌M2、發(fā)酵乳桿菌M4、鼠李糖乳桿菌C1[9]和解淀粉乳桿菌L6[10]，以及從直投式發(fā)酵劑XP1 中分離篩選并在豆?jié){中馴化得到了嗜熱鏈球菌ST3[11]等，將它們應(yīng)用于豆腐乳清發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分菌種能顯著改善風味，并提高其生物活性[12]。為了更詳盡研究乳酸菌發(fā)酵豆腐乳清的代謝作用及其對風味的影響，本文采用上述5 種乳桿菌與嗜熱鏈球菌聯(lián)合發(fā)酵豆腐乳清，應(yīng)用一維核磁共振氫譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析發(fā)酵前、后代謝物種類和含量的變化，探究菌種特性，為豆腐乳清的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用材料：豆腐乳清：廣東江門某腐乳廠提供；所用菌株：哈爾濱乳桿菌M1（Lactobacillus hurbimesis M1），黏膜乳桿菌 M2（Lactobacillus mulosae M2），發(fā)酵乳桿菌M4（Lactobacillus fermentum M4），鼠李糖乳桿菌C1（Lactobacillus rhamnosus C1），解淀粉乳桿菌L6（Lactobacillus.amylolyticus L6）（保藏號：CGMCC 9090），分離自豆腐酸漿水，嗜熱鏈球菌ST3（Streptococcus thermophilus）（保藏號：CGMCC 11943），從直投式發(fā)酵劑XP1 分離并在豆奶中馴化，保存于本實驗室，以下簡稱M1、M2、M4、C1、L6，ST3。

所用試劑：M17 肉湯培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基，購于廣州環(huán)凱生物科技有限公司；D2O（0.05%tmsp） 分析純，購于青島微波騰龍有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；600 M 超導核磁共振波譜儀，德國Bruker 公司；氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀，島津企業(yè)管理有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠；真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；固相微萃取裝置，美國Supelco 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 將乳桿菌M1、M2、M4、C1 和L6 分別接種于50 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，同時將ST3 接種于45 mL 的M17 培養(yǎng)基中，于42 ℃條件下培養(yǎng)24 h，在8 000 r/min，4 ℃的條件下離心5 min 獲得M1、M2、M4、C1、L6、ST3 菌體，用25 mL 無菌水復溶，沖洗菌體兩次。在8 000 r/min，4 ℃條件下離心獲得M1、M2、M4、C1、L6、ST3 菌體，使用15 mL 無菌水復溶。將取自腐乳廠的豆腐乳清進行離心，去除沉淀，于121 ℃滅菌15 min，4 ℃冷藏備用。將5 組發(fā)酵 劑M1 和ST3、M2 和ST3、M4 和ST3、C1 和ST3、L6 和ST3 按1:1 的比例進行混合，按照2%的接種量分別接入到上述滅菌豆腐乳清中，在37℃下發(fā)酵36 h，獲得樣品。

1.3.2 基于1H NMR 分析豆腐乳清發(fā)酵前后代謝產(chǎn)物的變化 核磁共振分析方法參考文獻資料[13-14]，略有修改。首先對樣品前處理：將各組樣品pH 值調(diào)至6.0，于8 000 r/min 下離心7 min，取上清液于-20 ℃冰箱預凍24 h，將預凍后的樣品置于真空冷凍干燥機中凍干，獲得樣品的凍干粉末，密封保存待用；然后制備待測樣品：將上述制得的各樣品凍干粉末溶解于600 μL 含有0.05% Tmsp（內(nèi)標物） 的D2O 中，混合均勻后轉(zhuǎn)移至5 mm NMR 管中，待檢測；核磁檢測參數(shù)：樣品均在600 M 超導核磁共振波譜儀上進行檢測；檢測頻率為600.17 MHz，配備5 mm TXI 反相三共振探頭；采樣溫度為室溫，掃描次數(shù)128 次，放松延遲（Relaxation Delay）5.000 s，脈沖寬度（Pulse Width）為12.7 μs，采用脈沖序列（Pulse Sequence）NOESYGPPR1D 的預飽和技術(shù)實現(xiàn)對水峰信號的完全抑制。

1.3.3 GC-MS 測定發(fā)酵豆腐乳清揮發(fā)性風味成分 采用固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC-MS）對發(fā)酵前后豆腐乳清的揮發(fā)性風味成分進行測定，測定方法參考本課題組前期研究報道[15]，稍做修改。首先對樣品進行固相微萃?。河? mL 移液槍吸取5 mL 樣品至20 mL 的頂空進樣瓶中，用錫紙和封口膠密封瓶口，在40 ℃下保溫10 min 后將萃取頭插入進樣瓶中，用磁力攪拌器控制攪拌速度為50 r/min，溫度40 ℃，萃取30 min。首次使用該萃取頭需先在240 ℃老化30 min，防止樣品之間交叉污染。

色譜條件：采用島津 （SHIMADZU GCMSQP2010Ultra）對所有的樣品進行檢測，使用的是極性色譜柱：Rtx-wax 毛細血管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；萃取頭插入后需要在進樣口吸3 min；載氣使用高純度的He；進樣口溫度：240 ℃；流速：1.0 mL/min，不采取分流。程序升溫的過程：初始溫度為35 ℃，保持此溫度3 min，然后以3 ℃/min 的速度升溫至80 ℃，再以4 ℃/min 的速度升溫至120 ℃，再以10 ℃/min 的速度升溫至230℃，保持此溫度2 min，整個分析過程的時間為41 min。質(zhì)譜使用的條件：離子源溫度為230 ℃，接口溫度為240 ℃，質(zhì)量掃描范圍為35～450 amu，離子源EI 為70 eV。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析和處理 核磁共振檢測結(jié)果先用Mestrenova（西班牙Mestrelab Research 公司）進行手動矯正相位和基線，化學位移用Tmsp（δ=0）定標，再使用Chenomx NMR（武漢安隆科訊技術(shù)有限公司）進行個體代謝物的鑒定和定量分析，得到的結(jié)果使用origin 2018 （originlab 公司） 進行分析。

GC-MS 檢測結(jié)果先用NIST 11s 庫進行檢索，選取匹配度高于80%的成分，得到初步結(jié)果，并用計算所得的RI 值與標準值作對比，來確定各色譜峰對應(yīng)的化學成分，得到的結(jié)果用峰面積/105表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于核磁共振氫譜（1H NMR）分析發(fā)酵豆腐乳清代謝產(chǎn)物

發(fā)酵豆腐乳清的一維核磁氫譜如圖1a～1f 所示。圖1a～1f 分別代表未發(fā)酵豆腐乳清、M1+ST3組發(fā)酵、M2+ST3 組發(fā)酵、M4+ST3 組發(fā)酵、C1+ST3發(fā)酵、L6+ST3 發(fā)酵的豆腐乳清的核磁圖譜。對發(fā)酵豆腐乳清的代謝物進行譜峰歸屬，根據(jù)Chenomx NMR 數(shù)據(jù)庫以及查閱相關(guān)資料，共指認出25 種代謝物質(zhì)，包括4 種多羥基化合物、12 種氨基酸、7 種有機酸以及2 種其它類物質(zhì)。指認代謝物的核磁位移和峰多重性如表1所示。從圖1a～1f 可以看出，豆腐乳清發(fā)酵前后的物質(zhì)種類差異不大，均指認出有4 種多羥基化合物：葡萄糖、果糖、蔗糖和阿拉伯糖醇。此外，在糖類物質(zhì)出峰區(qū)域（δH3.10-δH5.2）產(chǎn)生了信號重疊，難以對這些糖類進行鑒定，但從發(fā)酵前后的譜圖對比可以看出，發(fā)酵后的糖類物質(zhì)出峰區(qū)域面積較發(fā)酵前有所減少，這表明乳酸菌在發(fā)酵過程中都能大量的利用糖類物質(zhì)。此外，還指認出了12 種氨基酸，分別是亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸；指認了7 種有機酸，分別是丁酸、丙酸、乳酸、醋酸、丙酮酸、琥珀酸和檸檬酸。此外，還指認了4-氨基丁酸和膽堿。

圖1 發(fā)酵豆腐乳清的核磁圖譜Fig.1 NMR spectrum of fermented tofu whey

表1 發(fā)酵豆腐乳清代謝物的核磁數(shù)據(jù)Table 1 NMR data for metabolites of fermented tofu whey samples

（續(xù)表1）

圖2a～2d 為豆腐乳清發(fā)酵前、后化學成分的含量變化。從圖2a 中糖類物質(zhì)的變化可以看出，5個發(fā)酵組經(jīng)過發(fā)酵后蔗糖含量均減少。值得注意的是，5 個發(fā)酵組阿拉伯糖醇的含量較發(fā)酵前均有所增加，含量最高的是L6+ST3 組，C1+ST3 組次之。此外，L6+ST3 組和C1+ST3 組發(fā)酵后果糖含量升高，表明這2 組發(fā)酵劑對果糖的利用率不高。從圖2b 中可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后生成了大量的乳酸和乙酸，其中L6+ST3 組乳酸和乙酸的比例接近1∶1。從圖2c 可以看出，發(fā)酵后琥珀酸顯著增加，其中M4+ST3 組增加了4.7 倍；但5 個發(fā)酵組檸檬酸的含量均明顯減少，說明檸檬酸可被這些乳酸菌代謝利用；GABA 與膽堿含量在發(fā)酵后也有一定增加，但幅度不大。從圖2d 則可以看到，發(fā)酵前后蘇氨酸的含量最高，其次是甘氨酸和谷氨酸，且這3種氨基酸含量經(jīng)L6+ST3 組發(fā)酵后都有所增加。

圖2 豆腐乳清發(fā)酵前后代謝含量變化Fig.2 Changes of metabolic content of tofu whey during the fermentation

從上述代謝物含量的變化可以看到，不同的菌種對糖的利用及產(chǎn)酸的情況不同。其中，L6+ST3組對蔗糖的利用率最低，且對果糖的利用率不高，但會產(chǎn)生較高含量的阿拉伯糖醇。同時，這組發(fā)酵劑產(chǎn)生的乳酸較少。由于果糖是最甜的單糖，而阿拉伯糖醇既是一種甜味劑，又是生產(chǎn)木糖醇的中間體[16]，因此可以預見由這組發(fā)酵劑制備的發(fā)酵豆腐乳清將獲得良好的滋味。此外，乳酸菌的檸檬酸鹽代謝可以產(chǎn)生揮發(fā)性化合物，在發(fā)酵乳制品中這些化合物為C4 化合物，如乙偶姻和丁二醇是許多發(fā)酵乳制品的典型香氣化合物[17]。

從上述代謝物含量的變化還可以看到，不同菌種發(fā)酵后產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)乙酸、丙酸、丁酸，以及4-氨基丁酸（GABA）和膽堿有一定的差異，但差異不顯著。乙酸、丙酸和丁酸是腸道中主要的短鏈脂肪酸（SCFAs）[18]，它們既能為大腸細胞提供大量能量，參與機體能量代謝，又能調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和激素的產(chǎn)生[19]，并對糖尿病、肥胖癥、結(jié)腸炎等慢性疾病有一定的改善作用[20-23]。GABA 在一定程度上能夠緩解焦慮、緊張等情緒，同時還可預防慢性腎臟疾病，幫助預防糖尿病，以及改善某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病[24-26]。膽堿是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)，缺乏可能會導致肝損傷等疾病[27]。2018年，Nature 的報道表明琥珀酸能夠刺激小鼠脂肪細胞產(chǎn)熱，來抵抗飲食誘導的肥胖和血糖問題[28]。而本文的研究結(jié)果顯示，發(fā)酵乳桿菌M4 可能擁有較強的產(chǎn)生琥珀酸的能力，值得進一步研究。

2.2 基于GC-MS 分析發(fā)酵豆腐乳清的揮發(fā)性風味成分

發(fā)酵豆腐乳清的總離子流譜如圖3所示，揮發(fā)性成分及其豐度如表2所示。共檢測到95 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括31 種醇類、14 種醛類、21 種酮類、10 種酯類、9 種酸類、4 種酚類以及6 種其它類物質(zhì)。從圖譜可以看出，發(fā)酵后豆腐乳清的揮發(fā)性成分有了較大的變化。其中，觀察到M4+ST3 組的峰面積較小，這可能是因為發(fā)酵乳桿菌M4 進行異型乳酸發(fā)酵[29]，所產(chǎn)生的大量的二氧化碳氣體帶走了大部分的揮發(fā)性物質(zhì)。從表2可以看到以下變化，①發(fā)酵后醛類物質(zhì)在每一個發(fā)酵組中的豐度和種類都明顯減少，而豆腥味往往與正己醛等醛類物質(zhì)含量相關(guān)[30]。②經(jīng)C1+ST3 發(fā)酵后，醇類物質(zhì)特別是乙醇豐度有明顯增加；此外，雖然酯類物質(zhì)總的豐度有所減少，但增加了乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸異丙酯等特征性酯類香氣成分。③經(jīng)L6+ST3 發(fā)酵后，2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮等酮類物質(zhì)顯著增加，這些成分都具有令人愉悅的果香味[31]。④經(jīng)M1+ST3 發(fā)酵后，乙偶姻豐度顯著增加，并生成了2，3-丁二酮，與Zheng 等[8]的報道一致。

圖3 發(fā)酵豆腐乳清揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of volatile components in fermented tofu whey

表2 發(fā)酵豆腐乳清的揮發(fā)性香氣成分Table 2 Volatile components of fermented tofu whey

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

對表2中95 種揮發(fā)性物質(zhì)進行主成分分析，結(jié)果如圖4所示。第1 主成分（PC1）和第2 主成分（PC2）可以解釋59.7%的原變量信息，從圖4a 可以看出，醛類物質(zhì)集中在第一象限，酮類和酯類物質(zhì)較集中于第二象限，醇類和酸類物質(zhì)集中在第一、二象限，同時與圖4b 對應(yīng)，未發(fā)酵豆腐乳清位于第一象限，這說明未發(fā)酵豆腐乳清主要成分是醛類物質(zhì)，且發(fā)酵后的豆腐乳清集中在第二、三象限，均遠離發(fā)酵前的豆腐乳清，說明發(fā)酵前后的主成分有明顯的變化，其中，C1+ST3 組與L6+ST3組集中在第二象限，均含有較多的風味物質(zhì) （酯類、酮類），這與前面分析的結(jié)果一致。

圖4 發(fā)酵豆腐乳清揮發(fā)性成分的主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis of the volatile components of fermented tofu whey

綜合以上核磁共振氫譜分析和GC-MS 分析，乳酸菌經(jīng)過乳酸代謝，利用了蔗糖并生成了大量的乳酸和乙酸，同時經(jīng)過C4 代謝，利用了檸檬酸鹽，生成了乙偶姻、丁二酮等具有奶香味的物質(zhì)。有的乳酸菌則通過新鮮豆腐乳清含有的蘋果酸和富馬酸[32]生成琥珀酸[17]。同時，乳酸菌在發(fā)酵過程中利用了豆腐乳清的醛類物質(zhì)，增加了醇類和各種有機酸如丙酸、丁酸等，從而豐富了豆腐乳清的風味。這可能是由于豆腐乳清中的醛類物質(zhì)被醇脫氫酶還原成醇，以及被醛脫氫酶氧化成羧酸[33]。羧酸不僅是香氣成分，還是形成甲基酮、醇、內(nèi)酯和酯的前體[34]。此外，發(fā)酵過程產(chǎn)生了多種具有特征香氣的酮類和酯類物質(zhì)，明顯改善了豆腐乳清的風味，這可能是由不飽和脂肪酸的自氧化反應(yīng)生成的[35]。發(fā)酵后增加了GABA 含量，原因可能是乳酸菌經(jīng)過谷氨酸脫羧酶可以把谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA[35]。

3 結(jié)論

豆腐乳清的營養(yǎng)成分豐富，通過應(yīng)用從自然酸化的豆腐乳清中分離篩選所得的菌種來發(fā)酵豆腐乳清，能夠保證菌種對環(huán)境的適應(yīng)性，使其生長良好。豆腐乳清經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后短鏈脂肪酸和GABA、膽堿等功能性成分有所增加，不同的菌種發(fā)酵具有不同的風味特征。其中，C1+ST3 組和L6+ST3 組發(fā)酵劑，在增加豆腐乳清的營養(yǎng)成分和功能性成分，以及改善豆腐乳清風味方面表現(xiàn)最優(yōu)，可以作為發(fā)酵豆腐乳清的發(fā)酵劑，為發(fā)酵豆腐乳清飲料的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。