王鋒 徐靜 高亞南 崔利娜 付秀虹

漯河市中心醫(yī)院 河南，漯河 462000

子癇前期是一種常見特發(fā)性妊娠期綜合征，多發(fā)生于妊娠20周后，主要特征為初發(fā)高血壓、蛋白尿[1]。子癇前期發(fā)病與子宮螺旋動脈重塑異常、胎盤滋養(yǎng)細胞增殖及侵襲等因素有關(guān)，可嚴重影響母嬰健康，臨床上需加強早期的診斷、治療[2-3]。但目前尚無特效治療方法，西醫(yī)治療多以對癥處理為主，部分患者療效欠佳，且西藥長時間服用后不良反應(yīng)較多。中醫(yī)學(xué)的較多保胎處方中，中藥黃岑發(fā)揮著重要作用，可安胎、止血、解毒等。黃岑苷為黃岑主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗變態(tài)反應(yīng)、抗癌等作用[4]。楊小頎等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃岑苷能夠調(diào)節(jié)子宮母胎界面免疫狀態(tài)，降低CD4+/CD8+細胞比值，減少流產(chǎn)發(fā)生。但目前關(guān)于黃岑苷對子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲的影響研究較少，作用機制尚不明確。本研究擬建立子癇前期大鼠模型，分離、培養(yǎng)大鼠原代滋養(yǎng)細胞，探討黃岑苷對胎盤滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲的影響，并分析其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠36只，7周齡，體質(zhì)量240～280 g，其中雌性24只，雄性12只，均購于河南省實驗動物中心 [實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（豫）2017-0001]。所有大鼠均飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)藥物研究院[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（豫）2018-0004]，在恒溫恒濕環(huán)境內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，溫度20～25℃，濕度50%～70%，自由進食、飲水。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準（批號：LHZXYY-190041），實驗過程嚴格遵循減少（reduction）、替代（replacement）和優(yōu)化（refinement）的“3R”原則。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 黃岑苷（藥物純度≥98.6%）購于武漢市俊泰生物科技有限公司（批號：110715），使用前以0.9%氯化鈉溶液溶解，濃度為10.0 μg·mL-1；亞硝基左旋精氨酸甲酯、二氨基聯(lián)苯胺 （3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購于美國Sigma公司（批號：BCBF4375V、G7645）；戊巴比妥鈉購于德國默克公司（批號：P11011）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）購于武漢博士德生物工程有限公司（批號：AR1155）；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：011918180508）；杜爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco'smodification of Eagle's medium，DMEM）/F12購于美國Hyclone公司（批號：SH30023.01B）；免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物公司 （批號：SA102100）；兔抗大鼠細胞角蛋白-7（cytokeratin-7，CK-7） 一抗購于英國Novocastra公司（批號：1906247）；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體購于北京中山公司（批號：67905）；實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）試劑盒購于湖北武漢富鑫遠科技有限公司 （批號：180215）； 兔抗大鼠微小RNA-30d（microRNA-30d，miR-30d）-抗、兔抗大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞缺失同源物-1（glial cells missing homolog-1，GCM-1）一抗及山羊抗兔IgG二抗購于美國Santa Cruz公司（批號：180215、191023、25474）。

1.1.3 主要儀器 Transwell小室購于美國康寧公司；TGL-16G-A型高速冷凍離心機購于上海安亭儀器廠；SpectraMax M5多功能酶標儀為上海美谷分子儀器有限公司產(chǎn)品；DMi8-M型倒置相差顯微鏡為德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；FACSCalibur流式細胞儀購于美國Becton-Dickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 動物處理及模型制備 每日18：00至次日8：00，按照2∶1比例安排雌雄鼠合籠，次日清晨對雌鼠進行陰栓和陰道涂片檢查，若觀察到精蟲或陰栓，記為妊娠第1天。雌鼠自妊娠第13天起，給予10 mg·mL-1亞硝基左旋精氨酸甲酯皮下注射，劑量125 mg/（kg·d），1次/d，連續(xù)7 d[6]。 建模成功標準：建模后24 h，檢測大鼠血壓較實驗前升高＞20 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），尿蛋白（+）[7]。共20只雌鼠建模成功，成功率為83.33%。

1.2.2 原代滋養(yǎng)細胞分離、培養(yǎng)及傳代 參考文獻[8]的方法，從建模成功雌鼠中隨機選擇5只，妊娠第19～21天時以2%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，無菌條件下剖宮取胎，分離胎盤組織，洗凈表面血跡并剪碎，以含1%膠原酶Ⅰ和0.25%胰蛋白酶的Hank's液37℃下消化15 min。隨后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。1 800 r/min離心15 min，離心半徑8 cm，棄去上清液后以PBS洗滌、重懸。配制濃度分別為30%、60%的Percoll分離液，依次加入15 mL離心管，細胞懸液沿管壁加入。2 000 r/min離心20 min，離心半徑10 cm，取中間白膜層細胞，PBS洗滌2次后以含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞數(shù)量為1×104個·mL-1，接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h，觀察細胞貼壁情況。72～96 h后，待細胞成片生長，貼壁85%以上開始傳代，此后每隔3 d傳代1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 滋養(yǎng)細胞純度鑒定 采用免疫熒光法鑒定。收集細胞，吸凈培養(yǎng)基，以Hank's液洗滌，4%多聚甲醛固定48 h，PBS洗滌后加入0.5% Triton X-100，室溫下反應(yīng)20 min，洗滌后加入3% H2O2，室溫下反應(yīng)20 min。PBS洗滌后加入血清封閉液，37℃反應(yīng)20 min，甩干封閉液后加入兔抗大鼠CK-7一抗（稀釋比例：1∶100），37 ℃孵育2 h。PBS洗滌后加入FITC標記的羊抗兔IgG（稀釋比例：1∶1 500），孵育、洗滌后加入生物素化二抗工作液50 μL，室溫孵育20 min。 PBS洗滌，加入鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（streptavidin-biotin complex，SABC）孵育20 min。PBS洗滌后分別加入50 μL DAB顯色劑1和2，避光顯色15 min，自來水沖洗后鏡下觀察陽性細胞數(shù)并計算陽性細胞百分率，以鑒定細胞純度。

1.2.4 胎盤滋養(yǎng)細胞增殖活性檢測 采用MTT法檢測。選擇生長良好的滋養(yǎng)細胞，調(diào)整細胞濃度為1.0×104個·mL-1，接種至96孔板培養(yǎng)24 h。 待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加入不同濃度黃岑苷（20、40、60、80、100 μg·mL-1），另設(shè)空白組，加入不含黃岑苷的培養(yǎng)基，各組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入濃度為1 mg·mL-1的MTT液50 μL/孔， 繼續(xù)培養(yǎng)。800 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，棄去上清液。各孔加入含0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的DMEM培養(yǎng)基，室溫下振蕩10 min。待細胞內(nèi)紫藍色結(jié)晶溶解后，酶標儀檢測570 nm波長處吸光度（optical density，OD）值，評估細胞增殖活性。

1.2.5 含藥血清制備及細胞分組 將其余15只建模成功的雌鼠隨機分為對照組、黃岑苷低劑量組和黃岑苷高劑量組，每組各5只。黃岑苷按照成人與大鼠給藥等效劑量算換，成人臨床有效劑量為280 μg·mL-1，換算成大鼠等效劑量為25 μg·mL-1。黃岑苷低劑量組以等效量1.0倍灌胃，即25 μg·mL-1；黃岑苷高劑量組以等效量4.0倍灌胃，即100 μg·mL-1；對照組以0.3 mL蒸餾水灌胃。各組均每隔12 h灌胃1次，2次/d，共3 d。第4天時，灌胃1次給全天量，給藥后靜待1 h，以2%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，腹主動脈取血3 mL，靜置1 h后3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，分離血清。選取同一批傳代、密度相同、培養(yǎng)皿大小相同的原代滋養(yǎng)細胞，分為A組、B組和C組，分別以對照組、黃岑苷低劑量組、黃岑苷高劑量組大鼠血清培養(yǎng)48 h，收集各組細胞。

1.2.6 胎盤滋養(yǎng)細胞侵襲能力檢測 采用Transwell法檢測。細胞分組和處理同1.2.5，在聚碳酸酯微孔濾膜上平鋪人工基底膜Matrigel，37℃下靜置3 h，轉(zhuǎn)至室溫環(huán)境過夜。下室加入100 μL不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h。 調(diào)整細胞濃度1.0×105個·mL-1，將細胞懸液逐滴加入置于24孔板的Transwell小室，各組設(shè)5個復(fù)孔，沿空隙中將含10%血清培養(yǎng)基加入各孔，清除氣泡后培養(yǎng)24 h。取出濾膜，甲醛固定，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，200倍光鏡下計數(shù)10個視野內(nèi)的侵襲細胞數(shù)，評估滋養(yǎng)細胞侵襲能力。

1.2.7 miR-30d、GCM-1 mRNA表達檢測 采用Real-time qPCR法檢測。細胞分組和處理同1.2.5，收集各組培養(yǎng)24 h后滋養(yǎng)細胞，Trizol試劑盒提取總RNA，進一步逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行Real-time qPCR擴增。引物序列：miR-30d：F：5'-GGGGAATATGTTAAATTAA-3'，R：5'-AAACGGGGTCTACCGAGA-3'；GCM-1：F：5'-GAG CAGAGGTGTGCGGCAAC-3'，R：5'-GTGGTTTGATGTTGCAAGAGAGGC-3'；U6：F：5'-ACTCACGGCCGTGATGAG-3'，R：5'-TGATAGTCTCATCTCGGAA-3'；βactin：F：5'-GACATCGTGGTAAGATGAAGGA-3'，R：5'-TG TTGCTATATTCGTACCCAGCC-3'。反應(yīng)條件：94℃，5 min，預(yù)變性；94 ℃，35 s，變性；58 ℃，35 s，退火；72 ℃，35 s，延伸，35個循環(huán)。 以2-△△CT法計算miR-30d、GCM-1 mRNA表達水平。

1.2.8 GCM-1蛋白相對表達量檢測 采用免疫印跡法檢測。細胞分組和處理同1.2.5，收集各組培養(yǎng)24 h后滋養(yǎng)細胞，PBS洗滌2次。冰上裂解、勻漿30 min。4℃下13 500 r/min離心10 min，離心半徑8 cm。采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，加入等體積的2×上樣緩沖液，沸水浴變性10 min。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h。加入兔抗大鼠GCM-1（稀釋比例：1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜。以含有吐溫的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline Tween，TBST）洗膜后加入二抗（稀釋比例：1∶2 500），室溫孵育2 h。洗膜后以Image Quant LAS4000生物分子成像儀顯影曝光，觀察蛋白條帶灰度值。采用目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值計算目的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）-t檢驗。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滋養(yǎng)細胞分離、培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)3 h后開始貼壁，培養(yǎng)20 h時基本完全貼壁，培養(yǎng)24 h時發(fā)生聚集、融合，多為單個核細胞，也可見多核細胞，體積逐漸增大。培養(yǎng)72 h左右傳代，培養(yǎng)3～7 d時細胞融合增多，7 d后細胞退變，出現(xiàn)核固縮。免疫熒光鑒定顯示滋養(yǎng)層細胞表達CK-7，細胞純度（90.65±5.64）%。 見圖1。

圖1 原代滋養(yǎng)細胞形態(tài)觀察（20×）Fig.1 Morphology observation of primary trophoblast（20×）

2.2 滋養(yǎng)細胞形態(tài)學(xué)特征 原代滋養(yǎng)細胞經(jīng)消化、傳代后，倒置顯微鏡下檢查顯示外觀呈上皮樣細胞形態(tài)，多為長多邊形，體積大，核大呈卵圓形，呈片狀延展生長，貼壁后呈鋪路石樣。見圖2。

圖2 倒置顯微鏡觀察滋養(yǎng)細胞形態(tài)（100×）Fig.2 Observation of trophoblast under inverted microscope（100×）

2.3 各組滋養(yǎng)細胞增殖活性比較 各組間總體比較，OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）。 與空白組比較，20、40、60、80、100 μg·mL-1黃岑苷組OD值提升（P＜0.05）； 與20 μg·mL-1黃岑苷組比較，40、60、80、100 μg·mL-1黃岑苷組OD值提升（P＜0.05）；與40 μg·mL-1黃岑苷組比較，60、80、100 μg·mL-1黃岑苷組OD值提升 （P＜0.05）； 與60 μg·mL-1黃 岑 苷 組 比 較 ，80、100 μg·mL-1黃岑苷組OD值提升（P＜0.05）； 與80 μg·mL-1黃岑苷組比較，100 μg·mL-1黃岑苷組OD值提升 （P＜0.05）。 見圖3。

圖3 各組滋養(yǎng)細胞增殖活性比較Fig.3 Comparison of proliferative activity of trophoblast in each group

2.4 各組滋養(yǎng)細胞侵襲能力比較 各組間總體比較，胎盤滋養(yǎng)細胞侵襲細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與A組比較，B、C組侵襲細胞數(shù)增多（P＜0.05）；與B組比較，C組侵襲細胞數(shù)增多 （P＜0.05）。 見表1、圖4。

圖4 各組滋養(yǎng)細胞侵襲能力比較（HE染色，100×）Fig.4 Comparison of invasion ability of trophoblast in each group（HE staining， 100×）

表1 各組滋養(yǎng)細胞侵襲細胞數(shù)比較（±s，個/視野）Tab.1 Comparison of invasive cells of trophoblast in each group（±s， number/field）

表1 各組滋養(yǎng)細胞侵襲細胞數(shù)比較（±s，個/視野）Tab.1 Comparison of invasive cells of trophoblast in each group（±s， number/field）

注：與A組比較，◇P＜0.05；與B組比較，◆P＜0.05。Note:Compared with group A，◇P＜0.05;compared with group B，◆P＜0.05.

組別侵襲細胞數(shù)A 組 5 81.00±7.50 B 組 5 102.50±6.50◇C 組 5 126.50±7.50◇◆F值 50.218 P值 ＜0.01 n

2.5 各組滋養(yǎng)細胞miR-30d、GCM-1 mRNA表達水平比較 各組間總體比較，miR-30d、GCM-1 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與A組比較，B、C組miR-30d表達水平降低，GCM-1 mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與B組比較，C組miR-30d表達水平降低，GCM-1 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組miR-30d、GCM-1 mRNA表達比較（±s）Tab.2 Comparison of expression of miR-30d and GCM-1 mRNA in each group（±s）

表2 各組miR-30d、GCM-1 mRNA表達比較（±s）Tab.2 Comparison of expression of miR-30d and GCM-1 mRNA in each group（±s）

注：與A組比較，◇P＜0.05；與B組比較，◆P＜0.05。Note:Compared with group A，◇P＜0.05;compared with group B，◆P＜0.05.

組別 n miR-30d GCM-1 A 組 5 0.98±0.07 0.31±0.03 B 組 5 0.71±0.05◇ 0.54±0.05◇C 組 5 0.34±0.04◇◆ 0.81±0.07◇◆F值 172.056 113.193 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.6 各組滋養(yǎng)細胞GCM-1蛋白表達水平比較 各組間總體比較，GCM-1蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與A組比較，B、C組GCM-1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與B組比較，C組GCM-1蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見表3、圖5。

圖5 免疫印跡法檢測各組GCM-1蛋白表達Fig.5 Protein expression of GCM-1 in each group detected by Western blot

表3 各組滋養(yǎng)細胞GCM-1蛋白表達比較（±s）Tab.3 Comparison of expression of GCM-1 in each group（±s）

表3 各組滋養(yǎng)細胞GCM-1蛋白表達比較（±s）Tab.3 Comparison of expression of GCM-1 in each group（±s）

注：與A組比較，◇P＜0.05；與B組比較，◆P＜0.05。Note:Compared with group A，◇P＜0.05;compared with group B，◆P＜0.05.

組別GCM-1 A 組 5 0.21±0.05 B 組 5 0.46±0.07◇C 組 5 0.76±0.08◇◆F值 82.428 P值 ＜0.01 n

3 討論

現(xiàn)階段，子癇前期已逐漸成為引發(fā)孕、產(chǎn)婦死亡的一個重要原因，全球發(fā)病率高達2%～8%，受到臨床醫(yī)師和研究者的高度關(guān)注[9]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，子癇前期發(fā)病主要因為胎盤缺氧缺血、免疫功能下降、血管內(nèi)皮損傷等，引發(fā)胎盤滋養(yǎng)細胞功能障礙，從而造成胎盤功能異常，但其分子機制尚不明確，故目前仍無特效治療方法[10]。子癇前期在中醫(yī)理論中屬“子暈”“子眩”等范疇，中醫(yī)多從脾虛、腎虛、氣滯、血瘀等論治，認為其主要病機為氣血同病，氣血運行受阻，水停濕聚，濕邪重濁下滯，充任胞宮，郁久化熱，濕熱瘀結(jié)，因此多以滋陰潛陽、行氣活血、散瘀利濕清熱等藥物調(diào)理[11]。黃岑為中醫(yī)臨床常用的保胎藥材之一，可調(diào)節(jié)孕酮含量，有助于胚胎著床和維持妊娠，研究證實其成分黃岑苷具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，且可減輕腫瘤壞死因子-α導(dǎo)致的主動脈內(nèi)皮細胞損傷，維持內(nèi)皮細胞完整性[12]，但目前尚不明確黃岑苷對子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲能力的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，胎盤滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲能力的減弱在子癇前期發(fā)病中具有重要意義，且增殖、侵襲減弱程度與疾病嚴重程度相關(guān)[13]。黃岑苷屬于黃酮類化合物，近年來有報道提出，多數(shù)黃酮類化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗心肌缺血、保護神經(jīng)組織、降壓以及減輕生殖系統(tǒng)損傷等藥理作用[14]。本研究評估了不同濃度黃岑苷對子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)細胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示20、40、60、80、100 μg·mL-1黃岑苷組細胞OD值較空白組明顯提升，增殖活性增高，且細胞增殖活性與黃岑苷濃度之間存在量效關(guān)系，說明黃岑苷可促進胎盤滋養(yǎng)細胞的增殖活性，其作用呈劑量依賴性。另外，Transwell法檢測提示，黃岑苷還可增強滋養(yǎng)細胞侵襲能力，而且作用也呈劑量依賴性。

miRNA是長度為20～24個核苷酸的非編碼RNA家族[15]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA與子癇前期發(fā)生、發(fā)展有一定相關(guān)性，因此靶向調(diào)控miRNA逐漸成為子癇前期診斷及治療的新方向[16]。其中，miR-30d在腫瘤細胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[17]。王煥萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦胎盤組織中存在miR-30d高表達，認為其表達上調(diào)可能參與了子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。GCM-1為胎盤發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，參與滋養(yǎng)細胞浸潤過程，還可通過調(diào)節(jié)胎盤生長因子表達，促進胎盤血管生成[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃岑苷給藥后滋養(yǎng)細胞miR-30d表達水平降低，GCM-1 mRNA及蛋白表達水平升高，且效果呈劑量依賴性，提示黃岑苷可抑制miR-30d表達、上調(diào)GCM-1蛋白表達，這可能是黃岑苷提升子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)細胞增殖和侵襲能力的作用機制之一。

綜上所述，黃岑苷可提升子癇前期大鼠的胎盤滋養(yǎng)細胞增殖和侵襲能力，其作用機制可能與抑制miR-30d表達、上調(diào)GCM-1蛋白表達有關(guān)，這一結(jié)論可為臨床子癇前期防治工作提供一定的參考依據(jù)。另外，本研究也存在不足之處，如大鼠樣本量少，可能影響結(jié)果準確性；而且對機制的探討尚處于初級階段，仍不夠深入等。黃岑苷對子癇前期大鼠胎盤滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲影響的其他機制仍未明確，今后仍需進一步深入研究。