張進(jìn)忠，李悅淇，石 科，楊 亮，郭 丹

1.河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校檢驗(yàn)系，河南 鄭州 451191；

2.鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，河南 鄭州 450000

ESCC中mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路高度激活，抑制mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性使下游靶蛋白p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平下降，抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力［7］。激活m-TOR改變有絲分裂細(xì)胞的中心體定位，影響細(xì)胞定向分裂促進(jìn)腎囊腫的形成［8］。抑制mTORC1激酶的活性使有絲分裂紡錘體形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的定位受損，導(dǎo)致紡錘體組裝和胞質(zhì)分裂缺陷［9］。研究［10］顯示，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中敲低PLK4的表達(dá)可增強(qiáng)硼替佐米的抗腫瘤作用，可能由PTEN/PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)，細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激過程被激活。然而，PLK4是否通過調(diào)節(jié)mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與ESCC的進(jìn)程鮮見報(bào)道。本研究通過檢測(cè)ESCC細(xì)胞和組織中PLK4的表達(dá)水平，分析PLK4表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，下調(diào)PLK4的表達(dá)檢測(cè)ESCC細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，并探索其可能的分子機(jī)制，為ESCC診斷和治療提供潛在的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，PLK4抗體和β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，mTOR抗體、p70S6K抗體、p-mTORSer2448抗體和p-p70S6KThr421/Ser424抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 細(xì)胞株

正常食管上皮細(xì)胞Het-1A、人ESCC細(xì)胞系TE-1、TE-8和TE-13均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.3 病例資料

選取2017年1月—2019年12月河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院93例經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為ESCC患者的癌組織及其配對(duì)的癌旁組織（距原發(fā)灶邊緣5 cm以上）。入選標(biāo)準(zhǔn)：ESCC為原發(fā)性腫瘤并無其他腫瘤病史；未經(jīng)任何ESCC相關(guān)化療、免疫治療等；無食管手術(shù)治療史。其中男性43例，女性50例，年齡（55.32±10.23）歲。手術(shù)后立即將新鮮標(biāo)本進(jìn)行液氮凍存。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Het-1A細(xì)胞和ESCC細(xì)胞（TE-1、TE-8和TE-13）加入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

小鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后,固定于平板上。75%酒精消毒頸部皮膚后,做1 c m長(zhǎng)的切口,鈍性分離并暴露氣管,用1 mL注射器向肺內(nèi)注射50μL生理鹽水或LPS(5 mg/kg體重);將小鼠頭向上搖晃小鼠,讓液體在肺內(nèi)均勻分布;隨后將頸部切口縫合,讓自然蘇醒。

1.4.2 RTFQ-PCR檢測(cè)PLK4基因的表達(dá)

用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用于RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PLK4基因的表達(dá)。PLK4上游引物為5’-AATCAAGCACTCTCCAATC-3’，PLK4下游引物為5’-TGTGTCCTTCTGCAAATC-3’；β-actin上游引物為5’-GTTGCGTTACACCCTTT CTTG-3’，β-actin下游引物為5’-CACCTTCAC CGTTCCAGTTT-3’。反應(yīng)體系：cDNA 0.2 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR緩沖溶液29.25 μL，Real Master Mix 35.7 μL，ddH2O 33.85 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃10 min，30個(gè)循環(huán)：94 ℃15 s，60 ℃32 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算PLK4基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白水平

離心收集細(xì)胞后用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。臨床組織用液氮速凍后加入RIPA裂解液研磨提取組織總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取20 μg蛋白質(zhì)上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉4 ℃過夜封閉，一抗4 ℃過夜溫育，然后與HRP標(biāo)記的二抗室溫溫育1 h，ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，掃描儀掃描條帶并用Image J分析。

1.4.4 利用siRNA技術(shù)抑制TE-13細(xì)胞中PLK4的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-13細(xì)胞接種于6孔板，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合度達(dá)60%～80%，棄去培養(yǎng)基，每孔加入2.0 mL無血清培養(yǎng)基，其中含10 μL LipofectamineTM2000試劑和10 μL si-PLK4 RNA（或si-control RNA）混合均勻，繼續(xù)置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后棄去含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。本研究中si-PLK4 RNA序列順義鏈為5’-GACCTTATTCACCAGTTACTT-3’，反義鏈為5’-GACCTTATTCACCAGTT-3’；si-control RNA序列順義鏈為5’-UUCUCCG AACGUUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.4.5 CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將細(xì)胞接種到96孔板中（2×104個(gè)/孔），細(xì)胞貼壁后每孔加入10 μL CCK-8測(cè)定液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm處的吸光度（D）。細(xì)胞抑制率＝（D對(duì)照孔平均值-D實(shí)驗(yàn)孔平均值）/D對(duì)照孔平均值×100%。

將細(xì)胞接種到6孔板中（1×103個(gè)/孔），置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞至兩周，每隔3天更換培養(yǎng)液一次，當(dāng)克隆數(shù)停止增加時(shí)棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，再用結(jié)晶紫染色，計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)。

1.4.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將transwell小室置于24孔培養(yǎng)板的孔中，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。上室加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基和處理過的細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS清洗小室洗去多余的甲醛，加入1%的結(jié)晶紫室溫放置30 min，PBS清洗3次，用乙醇棉球擦拭上室未遷移的細(xì)胞，顯微鏡下取隨機(jī)視野觀察。

1.4.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞的融合度達(dá)到90%，用劃痕儀在6孔板下部的中心劃痕，形成劃痕后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在劃痕后0和48 h拍攝劃痕愈合單層的照片，計(jì)算每組細(xì)胞遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PLK4在各細(xì)胞中的表達(dá)差異用單因素方差分析。構(gòu)建受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）用于評(píng)估PLK4蛋白表達(dá)水平在診斷ESCC中的性能，計(jì)算cutoff值，統(tǒng)計(jì)PLK4蛋白表達(dá)診斷ESCC的靈敏度和特異度。用卡方檢驗(yàn)分析組織標(biāo)本中兩組間PLK4蛋白表達(dá)差異。Spearman相關(guān)性分析PLK4和ESCC病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性，Spearman偏相關(guān)性分析臨床分期和PLK4表達(dá)的凈相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLK4在ESCC細(xì)胞和組織中的表達(dá)

與Het-1A細(xì)胞相比，PLK4基因的mRNA在ESCC細(xì)胞中均呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，PLK4蛋白在各ESCC細(xì)胞中也呈高表達(dá)，與Het-1A相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖1 Het-1A和ESCC細(xì)胞株中的PLK4 mRNA表達(dá)Fig.1 Expression of PLK4 mRNA in Het-1A and ESCC cell lines

圖2 Het-1A和ESCC細(xì)胞株中的PLK4蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of PLK4 protein in Het-1A and ESCC cell lines

通過Western blot檢測(cè)ESCC組織和癌旁正常組織中PLK4蛋白的水平，繪制ROC曲線。結(jié)果顯示，AUC為0.841，95% CI：0.786～0.895，采用約登指數(shù)最大法得到cutoff值為1.343，靈敏度為74.2%（69/93），特異度為89.2%（83/93），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001，圖3，表1）。

表1 PLK4蛋白在ESCC組織和癌旁正常組織中的水平Tab.1 Level of PLK4 protein in ESCC and para-cancerous tissues

圖3 ESCC和癌旁正常組織中PLK4蛋白的水平Fig.3 Level of PLK4 protein in ESCC and para-cancerous tissues

2.2 PLK4蛋白水平與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

ESCC組織中PLK4蛋白水平與性別、年齡和腫瘤大小均無關(guān)（均P＞0.05），但與分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）。ESCC分化程度越低，PLK4陽性率越高，其中低分化程度的ESCC組織中PLK4陽性率為86.7%，Ⅲ～Ⅳ期患者ESCC組織中PLK4蛋白陽性率為92.3%（表2）。

表2 ESCC組織中PLK4蛋白水平與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Tab.2 Relationship between protein level of PLK4 in ESCC and clinical parameters

2.3 PLK4表達(dá)與ESCC臨床分期的相關(guān)性分析

ESCC組織中PLK4表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期均有相關(guān)性（P＜0.05），此外，PLK4表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)（r=0.604，P=0.000，表3）。為了研究臨床分期和PLK4表達(dá)的凈相關(guān)，經(jīng)Spearman偏相關(guān)控制分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這兩個(gè)因素后，PLK4表達(dá)與臨床分期之間的凈相關(guān)系數(shù)r為0.539（P=0.000）。

表3 PLK4表達(dá)與ESCC臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between PLK4 expression and ESCC clinic opathological parameters

2.4 抑制PLK4基因的表達(dá)對(duì)TE-13細(xì)胞增殖、侵襲遷移的影響

采用si-RNA干擾技術(shù)抑制ESCC細(xì)胞TE-13中PLK4的表達(dá)，RTFQ-PCR和Western blot結(jié)果顯示成功抑制TE-13細(xì)胞中PLK4的表達(dá)（P＜0.05，圖3）。CCK-8結(jié)果顯示，siRNA抑制PLK4的表達(dá)后，TE-13的增殖速度顯著低于對(duì)照（P＜0.05，圖4A），克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-PLK4組的克隆細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，圖4B和4C）。劃痕遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-PLK4組的細(xì)胞遷移率為16.67%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，圖4D）。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-PLK4組的細(xì)胞侵襲數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，圖4E和4F）。

圖4 抑制食管鱗癌細(xì)胞TE-13中PLK4的表達(dá)Fig.4 Inhibition of PLK4 expression in esophageal squamous cell carcinoma TE-13

2.5 抑制PLK4的表達(dá)對(duì)mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

為了研究PLK4對(duì)TE-13細(xì)胞增殖、侵襲和遷移影響的潛在機(jī)制，通過Western blot檢測(cè)了mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶蛋白的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，si-PLK4組mTOR和p70S6K蛋白的表達(dá)水平降低，分別為0.69（P＜0.05）和0.56（P＜0.05），此外，p-mTORSer2448和p-p70S6KThr421/Ser424的蛋白水平顯著低于對(duì)照組，分別為0.20（P＜0.05）和0.19（P＜0.05，圖5、6）。

圖5 抑制PLK4的表達(dá)對(duì)TE-13細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響Fig.5 Effect of inhibition of Plk4 expression on proliferation,invasion and migration of TE-13 cells

圖6 PLK4對(duì)TE-13細(xì)胞mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的影響Fig.6 Effects of PSMD7 on the activity of mTOR/p70S6K pathway in TE-13 cells

3 討 論

PLK4作為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白激酶，參與有絲分裂的多個(gè)步驟，如有絲分裂啟動(dòng)、中心體成熟、胞質(zhì)分裂等，同時(shí)還參與DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)和有絲分裂中期檢測(cè)點(diǎn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11-12］。有研究［13］結(jié)果顯示，PLK4在結(jié)直腸癌中的表達(dá)高于癌旁組織，并且與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。PLK4的高表達(dá)與腫瘤組織分級(jí)、惡性程度及腫瘤患者的預(yù)后呈正相關(guān)［14］，提示PLK4可能是腫瘤診斷、預(yù)后和化療的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

通過TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)PLK4 mRNA在食管腺癌和正常組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)食管腺癌組織中PLK4 mRNA表達(dá)的中位值是正常組織的8～9倍［15］，而PLK4在ESCC組織中的表達(dá)鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，PLK4在各ESCC細(xì)胞中的mRNA表達(dá)和蛋白水平均顯著高于正常食管上皮細(xì)胞，且ESCC組織標(biāo)本中PLK4蛋白的水平顯著高于癌旁正常組織。PLK4的表達(dá)水平診斷ESCC的AUC為0.841，靈敏度和特異度分別為74.2%和89.2%，PLK4蛋白水平與性別和年齡均無關(guān)（P＞0.05），但與分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），低分化程度的ESCC組織中PLK4陽性率最高，Ⅲ～Ⅳ期患者ESCC組織中PLK4陽性率最高，說明PLK4表達(dá)水平與ESCC的惡性程度有關(guān)，參與ESCC的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果表明PLK4表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)，控制分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移因素后，PLK4表達(dá)與臨床分期之間仍呈正相關(guān)。目前已經(jīng)鑒定了幾種PLK4的小分子抑制劑，其中一些正在臨床試驗(yàn)中。CFI-400945是第一種口服PLK4抑制劑，CFI-400945在PLK4過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中具有選擇性的抗腫瘤活性［16］。進(jìn)一步的研究證明了CFI-400945在多種腫瘤中具有顯著的抗腫瘤作用，包括胰腺癌［17］、肺癌［18］、肝癌［19］和乳腺癌［20］。YLT-11是一種新設(shè)計(jì)的選擇性PLK4抑制劑，Lei等［21］的研究表明YLT-11能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，并導(dǎo)致中心體復(fù)制和有絲分裂缺陷的失調(diào)，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。鑒于PLK4在ESCC中呈高表達(dá)，以及與臨床分期的正相關(guān)性，PLK4有望成為ESCC潛在的治療靶點(diǎn)。

在細(xì)胞增殖過程中mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮關(guān)鍵作用，并受其他蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)［22-23］。Wu等［24］探索了臨床ESCC組織標(biāo)本中mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各種靶蛋白水平與臨床病理學(xué)因素以及患者預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、延伸起始因子4E、結(jié)合蛋白-1等在腫瘤組織中顯著上調(diào)，mTOR和p70S6K的表達(dá)與總生存期相關(guān)，而p-mTOR與無進(jìn)展生存期相關(guān)，并證實(shí)mTOR的過表達(dá)是ESCC總體生存的獨(dú)立不良預(yù)后因素。白血病患者的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)Plk1的表達(dá)后使mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，并抑制細(xì)胞的凋亡［25］。在ESCC細(xì)胞系中，mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過多個(gè)絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化被激活［26］，下調(diào)PLK4不僅降低mTOR和p70S6K的表達(dá)，還可抑制p-mTORSer2448和p-p70S6KThr421/Ser424的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)PLK4引起的ESCC細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力的降低可能與mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。

本研究結(jié)果證實(shí)，PLK4在ESCC細(xì)胞系和組織中的高表達(dá)，與分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，PLK4可能通過mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制TE-13細(xì)胞的增殖和侵襲遷移能力。