張廷輝，湯承浩，王曉銘，胡秀虹▲，鐘艷子，張海蘭

(1黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556011；2凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011)

韭菜根是百合科蔥屬多年生宿根性植物——寬葉韭(AlliumhookeriThwaites)的肉質(zhì)根，主要產(chǎn)于云貴川和西藏[1-2]。腌韭菜根是貴州黔東南的一款本土特色食品，因其豐富的營養(yǎng)成分、獨特的風(fēng)味及保健功效，深受當(dāng)?shù)厣贁?shù)人們的喜愛。不過，韭菜根原料水分含量高又營養(yǎng)豐富，極易造成袋裝產(chǎn)品在貯存過程中的腐敗。研究表明，腌制蔬菜的變質(zhì)在一定程度上與其腐敗微生物的數(shù)量密切相關(guān)[3]。課題組研究發(fā)現(xiàn)致使腌韭菜根腐敗變質(zhì)的主要微生物是細(xì)菌[4-5]。

目前，測定細(xì)菌菌液濃度的方法主要有比濁法[6-7]、平板計數(shù)法[8]和顯微鏡計數(shù)法等。顯微鏡計數(shù)法雖然快速，但不能做出宏觀、全面的反應(yīng)；平板計數(shù)法重復(fù)性、平行性好但速度慢、工作量大；比濁法測定的一般為細(xì)菌總數(shù)(活菌數(shù)+死菌數(shù))，具有簡單、快速等優(yōu)點，對無色素產(chǎn)生、菌液顏色較淺的細(xì)菌而言，是一個不錯的選擇[9]。嚴(yán)佩峰、曹國珍等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)期的某一菌液濃度范圍內(nèi)，細(xì)菌菌液的吸光度與菌液濃度呈正相關(guān)性。近年來，也有研究進(jìn)一步證實，可采用比濁法結(jié)合平板計數(shù)法得到菌液活菌數(shù)與OD600值的線性關(guān)系，進(jìn)而通過吸光度測定能夠快速獲得菌液活菌數(shù)[12-14]。本文以腌韭菜根中分離獲得的五種腐敗菌為研究對象，采用比濁法與平板計數(shù)法探究菌液活菌數(shù)與OD值之間的相關(guān)性，以期在腐敗菌的后期腐敗特性、生長特性及防控等研究中為菌液活菌數(shù)的測定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

試驗用的細(xì)菌菌種見表1。常用試劑見表2。

表1 供試菌種Tab.1 Test strains

表2 試驗用試劑Tab.2 Reagents for the test

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA2004型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺，上海蘇凈實業(yè)有限公司；ZWY-CZ11D型恒溫?fù)u床培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器有限公司；BGZ-246型電熱鼓風(fēng)干燥箱、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50kbs型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BIO-BRI型酶標(biāo)儀，成都百樂科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

在無菌操作下，將4 ℃保藏的菌種，取2環(huán)接種到100 mL肉湯培養(yǎng)基中180 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)15～18 h。用移液管依次取菌液5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL分別置于編號為A、B、C、D、E的五個試管中，并用生理鹽水稀釋至10 mL，得到同株菌五個不同濃度梯度的菌懸液。

1.2.2 菌液活菌計數(shù)

參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》標(biāo)準(zhǔn)中的菌落計數(shù)方法，測定腌韭菜根中各腐敗細(xì)菌菌液的活菌數(shù)[15]，以cfu/g表示。具體操作如下：將五個編號的離心管分別進(jìn)行1∶10倍梯度稀釋，分別吸取10-5、10-6、10-7稀釋度菌液1 mL涂布于無菌平皿內(nèi)，待干燥后倒置于(36±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落總數(shù)測定。以滅菌生理鹽水作空白對照，平行實驗三次。

1.2.3 菌液OD值測定

使用移液槍移取編號 A、B、C、D、E五個離心管中的各菌懸液200 μL置于專用96孔板中，用酶標(biāo)儀在600 nm波長下測定其吸光度值。因菌懸液存在一定的濁度，使得它對光有一定的吸收，故可在特定波長下測量菌懸液的吸光度來體現(xiàn)細(xì)菌菌液的濃度[16]。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以菌液活菌數(shù)(cfu/mL)作為縱坐標(biāo)，菌液的OD600值作為橫坐標(biāo)，繪制各腐敗細(xì)菌的菌液活菌數(shù)與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 B2菌液OD值與活菌數(shù)的相關(guān)性

B2不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表3所示。由表3可知，B2各稀釋菌液的OD600均值在0.1003～0.3936，活菌數(shù)為6.1×107～13.8×107cfu/mL。

表3 B2各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.3 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B2 bacterial solution

以B2菌懸液的OD600值為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制OD600值與活菌數(shù)的線性關(guān)系圖，如圖1。由圖1可知，B2菌懸液的OD600值與其活菌數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=25.81x+3.25，R2=0.9842。

圖1 B2菌液活菌數(shù)與OD600相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B2 bacterial solution

2.2 B5菌液吸光度與活菌數(shù)的相關(guān)性

B5不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表4所示：B5各稀釋菌液的OD600均值在0.0734～0.3551，活菌數(shù)為3.4×107～8.5×107cfu/mL。

表4 B5各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.4 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B5 bacterial solution

B5菌液OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。由圖2可知，線性方程為y=16.63x+2.64，R2=0.9357，表明B5菌懸液的OD600值與其活菌數(shù)線性關(guān)系良好。

圖2 B5菌液活菌數(shù)與吸光度相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B5 bacterial solution

2.3 B7菌液吸光度與活菌數(shù)的相關(guān)性

B7不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表5所示：B7各稀釋菌液的OD600均值在0.0886～0.3911，活菌數(shù)為0.8×108～5.9×108cfu/mL。

表5 B7各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.5 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B7 bacterial solution

B7菌液OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。由圖3可知，線性方程為y=16.16x-0.0035，R2=0.9268，表明B7菌懸液的OD600值與其活菌數(shù)線性關(guān)系良好。

圖3 B7菌活菌數(shù)與吸光度相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B7 bacterial solution

2.4 B8菌液吸光度與活菌數(shù)的相關(guān)性

B8不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表6所示： B8各稀釋菌液的OD600均值在0.1067～0.6489，活菌數(shù)為1.1×106～4.9×106cfu/mL。

表6 B8各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.6 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B8 bacterial solution

以菌懸液的OD600值為X軸，活菌數(shù)為Y軸，繪制B8菌液OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。從圖4不難發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=7.25x+0.30，R2=0.9926，表明B8菌液OD600值與活菌數(shù)的線性關(guān)系良好。

圖4 B8菌液活菌數(shù)與吸光度相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B8 bacterial solution

2.5 B11菌液吸光度與活菌數(shù)的相關(guān)性

B11不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表7所示： B11各稀釋菌液的OD600均值在0.0673～0.3551，活菌數(shù)為3.1×107～15.1×107cfu/mL。

表7 B11各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.6 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B11 bacterial solution

B11菌液OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5。由圖5可知，線性方程為：y=40.31x+0.83，R2=0.9890，表明B11菌懸液的OD600值與其活菌數(shù)線性關(guān)系良好。

圖5 B11菌液活菌數(shù)與吸光度相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B11 bacterial solution

3 結(jié)論與討論

相同條件下培養(yǎng)供試菌(土揚(yáng)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、萵苣不動桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌)特定時間，并依次按0.5、0.4、0.3、0.2、0.1的梯度對各供試菌菌懸液進(jìn)行稀釋，得到其OD600值的范圍分別為：0.1003～0.3936、0.0734～0.3551、0.0886～0.3911、0.1067～0.6489和0.0673～0.3551；活菌總數(shù)范圍為：6.1×107～13.8×107cfu/mL、3.4×107～8.5×107cfu/mL、0.8×108～5.9×108cfu/mL、1.1×106～4.9×106cfu/mL和3.1×107～15.1×107cfu/mL。對比不難發(fā)現(xiàn)，不同的菌種由于生長速度不同，其菌液濃度(吸光度及活菌總數(shù))有很大的區(qū)別。

林靜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，菌液的吸光度與其活菌數(shù)成良好的線性關(guān)系，根據(jù)其線性方程測得吸光度就可得出相應(yīng)菌液的活菌數(shù)，且計算所獲得的活菌數(shù)的準(zhǔn)確度越高，線性方程相關(guān)性系數(shù)(R2)需越接近1。本文進(jìn)一步研究腌韭菜根中的5種供試菌菌液的OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性，得到其線性方程及相關(guān)性系數(shù)為：土揚(yáng)芽孢桿菌：y=25.81x+3.25，R2=0.9842；巨大芽孢桿菌y=16.63x+2.64，R2=0.9357；萵苣不動桿菌y=16.16x-0.0035，R2=0.9268；解淀粉芽孢桿菌：y=7.25x+0.30，R2=0.9926；蠟樣芽孢桿菌y=40.31x+0.83，R2=0.9890。該研究對腌韭菜根中的腐敗菌的深入研究以及菌液濃度的快速測定具有十分重要的意義。