基于腸道菌群代謝產(chǎn)物探索低FODMAPs飲食對腹瀉型腸易激綜合征的療效及機制研究

俞蕾敏,翁敏娜,陳慧俊,葉 蔚,范一宏

俞蕾敏,翁敏娜,陳慧俊,葉蔚,浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省杭州市 310007

范一宏,浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省杭州市 310006

0 引言

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是最常見的功能性胃腸道疾病之一,發(fā)病率較高,采用羅馬Ⅳ標(biāo)準[1],全球患病率為3.8%[2].隨著近年來生活節(jié)奏加快、工作壓力加大,我國人群IBS的患病率呈上升趨勢,發(fā)病率達5%(羅馬Ⅳ標(biāo)準)[3].臨床上以腹瀉型IBS(diarrheatype irritable bowel syndrome,IBS-D)最為常見.該病目前藥物治療效果欠佳,導(dǎo)致患者頻繁就診與檢查,嚴重影響其工作和生活質(zhì)量,造成極大的心理及經(jīng)濟負擔(dān).腸道菌群紊亂與IBS發(fā)生密切相關(guān)[4],而飲食可以改變腸道微生物組成及其功能[5].控制飲食目前成為IBS一線治療方式的候選者.低可發(fā)酵的寡糖、雙糖、單糖、多元醇(fermentable oligosaccharides,disaccharides,monosaccharides and polyols,FODMAPs)飲食可有效改善IBS患者的臨床癥狀[6].食物成分和微生物群之間的相互作用可為IBS病理生理學(xué)提供機制上的新見解.本研究前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸(phenylalanine,PHE)為IBS模型組小鼠與正常對照組小鼠之間的關(guān)鍵代謝通路[7].PHE可通過鈣敏感受體(calcium-sensing receptor,CaSR)刺激胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)釋放[8],而GLP-1是一種與飽腹感相關(guān)的腸肽激素,具有抗炎活性[9].2021-01/2021-06,我們采用低FODMAPs飲食對IBS-D患者進行干預(yù),觀察其臨床癥狀的變化,并對其作用機制進行了初步研究.現(xiàn)報道如下.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料:(1)基本情況:2021-01/2021-06選擇在我院消化內(nèi)科門診就診,符合羅馬Ⅳ標(biāo)準[1]的IBS-D患者,共30例.同時征集30名健康志愿者作基線檢測對照.本研究通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院臨床研究倫理委員會審核(倫理研究批件號:2020LH004),并與研究對象簽署知情同意書.(2)納入標(biāo)準:①符合腹瀉型IBS羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(處于癥狀發(fā)作期);②年齡20-70歲;③無器質(zhì)性疾病和生化異常的證據(jù),如甲狀腺功能、血沉、腫瘤標(biāo)志物、糞便常規(guī)、腹部B超、內(nèi)鏡等相關(guān)檢查均無異常發(fā)現(xiàn);④與醫(yī)生溝通良好,簽署知情同意書者.(3)排除標(biāo)準:①妊娠或哺乳期婦女;②因器質(zhì)性疾病出現(xiàn)腹痛、腹瀉者;③有腹部手術(shù)者;④存在嚴重精神疾病及心、腦、肝、腎等系統(tǒng)并發(fā)癥的患者;⑤藥物濫用或酗酒者;⑥有特殊飲食者;⑦測試期間出現(xiàn)食物過敏史者;⑧實驗前4周內(nèi)曾使用益生菌、抗生素或含有類似成分的中藥等影響本研究的藥物.(4)中止和脫落標(biāo)準:①無法堅持治療的受試者;②研究對象未能實施治療方案;③出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng),不宜繼續(xù)進行低FODMAPs飲食者;④在治療過程中病情惡化;⑤未能按研究計劃完成回訪者被認為是脫落.

1.1.2 體外實驗材料:采用NCI-H716細胞,購自中國科學(xué)院上海分院.PHE(P5482-10MG)購于Sigma-Aldrich公司.

1.2 方法

1.2.1 干預(yù)方法:由一名營養(yǎng)科醫(yī)生和一名研究方向為IBS的消化內(nèi)科醫(yī)生組成飲食指導(dǎo)小組,指導(dǎo)受試者飲食.由飲食指導(dǎo)小組向該組患者發(fā)放FODMAPs飲食列表,并采用一對一指導(dǎo)結(jié)合集體宣教的方式對該組患者進行飲食指導(dǎo).要求所有受試者的飲食嚴格遵循低FODMAPs飲食列表目錄[10].并且要確保五類食物的攝入:奶、肉類、水果、蔬菜和豆類.干預(yù)時間為4周.飲食干預(yù)期間無相關(guān)藥物治療.

1.2.2 體外細胞實驗:NCI-H716 細胞為腸道L細胞系,來源于人低分化盲腸腺癌,具有內(nèi)分泌特性,可分泌GLP-1.將NCI-H716細胞用含5%胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基復(fù)蘇后,接種于25 CM2培養(yǎng)瓶,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).取生長狀態(tài)良好的細胞,待細胞達90%時接種于六孔板,每孔達到1×105個細胞的接種量.將PHE溶于1 mol/L鹽酸中配制成200 mmol/L的母液,并用完全培養(yǎng)液配制成相應(yīng)濃度的工作液.實驗分組如下:①空白對照組;②低劑量PHE組:0.25 mmol/L PHE;③中劑量PHE組:0.5 mmol/L PHE;④高劑量PHE組:1.0 mmol/L PHE.預(yù)處理24 h.設(shè)兩組復(fù)孔,每組三次重復(fù).

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 臨床癥狀評分:對健康對照組及飲食干預(yù)組患者治療前,及4周治療結(jié)束后臨床癥狀進行評分:(1)IBS癥狀嚴重程度量表(IBS symptom severity scale,IBS-SSS):IBS-SSS量表總分為500分,每個條目的分值范圍為0-100分.總分低于75分為緩解期,輕度、中度及重度的界值分別為75-175,175-300,300分以上[10];(2)糞便性狀:采用Bristol評分[11],l-7型分別對應(yīng)l-7分;(3)排便頻率[12]:分為6級:≤2次/wk,3次/wk,1次/d,2 次/d,3次/d,＞3次/d,分別對應(yīng)l-6分.

1.3.2 血清檢測指標(biāo):分別于清晨空腹采集健康志愿者,及治療前、4周治療結(jié)束后IBS患者靜脈血8-10 mL,3000 r/min離心15 min,提取血清.標(biāo)本置于-80 ℃冰箱保存待測.采用ELISA法測定血清PHE,GLP-1,TNF-α,IFN-γ.試劑盒由上海泛柯實業(yè)有限公司提供,操作嚴格按試劑盒說明進行.

1.3.3 細胞上清液檢測指標(biāo):細胞實驗結(jié)束后提取各組細胞上清液,置于-80 ℃冰箱保存待測.采用ELISA法測定細胞上清液GLP-1.試劑盒由上海泛柯實業(yè)有限公司提供,操作嚴格按試劑盒說明進行.

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析.對正態(tài)分布的計量資料進行t檢驗,非正態(tài)分布變量及計數(shù)資料進行秩和檢驗或χ2檢驗.以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 基本情況 入組者無一例出現(xiàn)不良反應(yīng),均未發(fā)生脫落和剔除病例.入組IBS患者平均病程為16.90 mo±0.97 mo.各組人群基本資料中性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)方面,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,具有可比性.結(jié)果見表1.

表1 正常組及IBS組患者性別、年齡及BMI指數(shù)

2.2 臨床癥狀評分 與正常組相比,治療前IBS組患者IBSSSS評分,Bristol評分,排便頻率評分均升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001 &P＜0.001);治療后患者IBS-SSS評分,Bristol評分,排便頻率評分均較治療前下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001 &P＜0.001).表2,3.

表2 正常組及IBS組患者治療前后IBS-SSS評分(n=30,mean±SD)

2.3 血清PHE,GLP-1及促炎細胞因子測定 與正常組比較,治療前IBS組患者血清PHE和GLP-1濃度下降,TNF-α,IFN-γ濃度升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001);經(jīng)治療后,IBS組PHE和GLP-1濃度較前上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),TNF-α和IFN-γ濃度較前下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001 &P＜0.001),表4.

表4 正常組及IBS組患者治療前后PHE、GLP-1、促炎細胞因子濃度(n=30,mean±SD)

表3 正常組及IBS組患者治療前后Bristol評分及排便頻率評分[n=30,中位數(shù)(25%,75%)]

2.4 PHE干預(yù)對細胞分泌GLP-1的影響 將不同濃度(0.25 mmol/L,0.5 mmol/L,1 mmol/L)PHE加入NCI-H716細胞進行干預(yù)后發(fā)現(xiàn),隨著PHE濃度增加,GLP-1表達水平逐步上升,1 mmol/L PHE可以顯著促進GLP-1分泌,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),表5.

表5 PHE干預(yù)對細胞分泌GLP-1的影響(mean±SD)

3 討論

IBS發(fā)病機制復(fù)雜.腸道微生物參與IBS發(fā)生的病理生理過程[13].腸道菌群失衡可能通過細菌作用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物影響神經(jīng)遞質(zhì)、激素、免疫分子的平衡,進而導(dǎo)致腸道功能紊亂.Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)IBS患者腹痛和內(nèi)臟超敏反應(yīng),與腸道菌群糞便代謝產(chǎn)物異戊酸,戊酸和異己酸相關(guān).本研究結(jié)果表明,與健康志愿者相比,IBS患者血清PHE降低,提示IBS腸道菌群代謝產(chǎn)物發(fā)生改變.

PHE對GLP-1釋放有促進作用.GLP-1由末端空腸、回腸和結(jié)腸的朗罕氏細胞所分泌.研究發(fā)現(xiàn),進食15-180分鐘內(nèi),多達60%的IBS患者會出現(xiàn)癥狀發(fā)作或惡化,提示與飽腹感相關(guān)的激素可能在IBS病理生理過程中起一定作用[15].GLP-1與腸道炎癥反應(yīng)存在密切關(guān)系.Kissow等[16]研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可顯著降低化療后小鼠的腸道粘膜炎癥程度評分.二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase,DP)抑制劑(抑制GLP-1滅活)可以改善結(jié)腸炎模型小鼠的結(jié)腸炎癥,引起促炎細胞因子TNF-α和IFN-γ分泌減少,以及抗炎細胞因子TGF-β分泌增加[17].本課題研究發(fā)現(xiàn),與健康志愿者相比,IBS患者血清中GLP-1分泌下降,TNF-α和IFN-γ分泌增加.體外實驗發(fā)現(xiàn)隨著PHE濃度的逐漸增加,GLP-1表達水平逐步上升,高濃度的PHE可以顯著促進GLP-1分泌.因此,推測PHE通過介導(dǎo)GLP-1調(diào)控促炎細胞因子分泌,參與IBS-D的病理生理過程.

IBS作為一種胃腸道疾病,與飲食關(guān)系密切.低FODMAPs飲食可有效改善50%-80%IBS患者癥狀,尤其是腹脹腹瀉等癥狀[18].Varjú等[19]進行薈萃分析,表明與傳統(tǒng)的IBS飲食相比,保持低FODMAPs飲食的IBS患者的總體癥狀評分得到改善,顯示出其優(yōu)于常規(guī)IBS飲食治療的優(yōu)勢.本研究發(fā)現(xiàn),患者經(jīng)低FODMAPs飲食治療后,其IBS-SSS評分,排便頻率及糞便性狀明顯改善,提示低FODMAPs飲食有助于改善IBS-D患者臨床癥狀.

飲食中可酵解短鏈碳水化合物的攝入可誘發(fā)或顯著加劇IBS癥狀[20].飲食因素可以影響腸道菌群結(jié)構(gòu).研究發(fā)現(xiàn)用高FODMAPs飲食喂養(yǎng)大鼠,其糞便革蘭氏陰性細菌和血清脂多糖含量增加,并伴有腸道炎癥,屏障功能障礙和內(nèi)臟超敏反應(yīng)增加[21].Mcintosh等[22]發(fā)現(xiàn),低FODMAPs飲食增加了腸道放線菌的豐富度和多樣性.楊斌等[23]研究發(fā)現(xiàn)低FODMAPs飲食治療28天,患者大腸桿菌數(shù)量較前減少,提示低FODMAPs飲食有調(diào)節(jié)腸道菌群及其比例的作用.張亮等[24]研究發(fā)現(xiàn)IBS大鼠存在腸道菌群失調(diào)和部分氨基酸代謝異常,與IBS疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān).腸道菌群C.sporogenes、Clostridium botulinum與PHE代謝相關(guān)[25].李佳琪等[26]對腸道菌群和關(guān)鍵代謝途徑中的代謝物進行Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),Christensenellaceae菌科與PHE呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)大于0.7).因此我們推測經(jīng)飲食調(diào)節(jié)后,宿主腸道菌群發(fā)生改變,進而影響菌群代謝產(chǎn)物發(fā)生改變.在本實驗中,行低FODMAPs飲食治療后,患者血清PHE水平較治療前升高,同時血清GLP-1亦升高,TNF-α和IFN-γ分泌下降,提示飲食治療可能通過影響PHE的含量,進而調(diào)控GLP-1分泌,抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生.

4 結(jié)論

綜上所述,低FODMAPs飲食對IBS-D患者具有一定的治療效果.該治療方法易于被患者掌握,對于存在藥物禁忌癥的患者或不愿意接受藥物治療的患者而言,無疑是一種較佳選擇.因本研究周期較短,樣本量較小,故低FODMAPs飲食的遠期療效,及其是否導(dǎo)致機體營養(yǎng)狀況下降等不良后果,需在將來行多中心,大樣本,長期隨訪的臨床試驗來明確.此外,腸道菌群與PHE之間的具體調(diào)控機制,將在今后開展動物實驗及細胞實驗明確.

文章亮點

實驗背景

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是常見的功能性胃腸道疾病之一.腸道菌群代謝產(chǎn)物苯丙氨酸(phenylalanine,PHE)與IBS發(fā)病相關(guān).PHE可刺激與飽腹感相關(guān)的腸肽激素胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)釋放.低可發(fā)酵的寡糖、雙糖、單糖、多元醇(fermentable oligosaccharides,disaccharides,monosaccharides and polyols,FODMAPs)飲食是目前新興的IBS治療方法之一.

實驗動機

關(guān)于低FODMAPs飲食是否影響通過腸道菌群代謝產(chǎn)物PHE的產(chǎn)生進而在IBS治療上發(fā)揮作用的研究報道較少.本實驗結(jié)果有助于為該飲食治療提供實驗室依據(jù).

實驗?zāi)繕?biāo)

闡明低FODMAPs飲食通過腸道菌群代謝產(chǎn)物PHE調(diào)控GLP-1在IBS患者治療中的分子機制.為該飲食治療的推廣提供理論基礎(chǔ).

實驗方法

以本院消化內(nèi)科門診腹瀉型IBS患者為研究對象,通過對干預(yù)前后患者臨床癥狀的調(diào)查,闡明低FODMAPs飲食的治療效果;運用ELISA法檢測患者血清PHE、GLP-1,闡明飲食干預(yù)前后PHE及GLP-1的變化;運用ELISA法檢測患者血清TNF-α,IFN-γ,闡明飲食干預(yù)前后機體促炎細胞因子的變化.同時行體外實驗,明確PHE對GLP-1分泌的促進作用.

實驗結(jié)果

經(jīng)低FODMAPs飲食干預(yù)后,IBS患者臨床癥狀得到改善,血清PHE和GLP-1濃度較干預(yù)前上升,促炎細胞因子TNF-α和IFN-γ濃度較干預(yù)前下降.體外實驗發(fā)現(xiàn),高濃度PHE可以顯著促進GLP-1分泌.

實驗結(jié)論

本實驗闡明了腹瀉型IBS疾病過程中,宿主腸道菌群代謝產(chǎn)物PHE生成異常,導(dǎo)致不能有效促進GLP-1釋放進而引發(fā)炎癥反應(yīng);闡明了低FODMAPs飲食可通過影響PHE刺激GLP-1分泌進而抑制炎癥反應(yīng).明確飲食-腸道菌群代謝產(chǎn)物-內(nèi)分泌激素之間存在交互作用.

展望前景

未來需行多中心,大樣本,長期隨訪的臨床試驗來明確低FODMAPs飲食遠期療效,及其是否導(dǎo)致機體營養(yǎng)狀況下降等不良后果.此外,腸道菌群與腸道菌群代謝產(chǎn)物之間的具體調(diào)控機制,將在今后開展動物實驗及細胞實驗明確.