譚琦煥,謝王亮,駱俞婷,蔣寧芳,馬阿火

譚琦煥,謝王亮,駱俞婷,紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院 浙江省紹興市 312000

蔣寧芳,紹興市人民醫(yī)院胃腸外科 浙江省紹興市 312000

馬阿火,紹興文理學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省紹興市 312000

0 引言

胃癌是最常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤,占癌癥發(fā)病率的第五位,但是其死亡率卻居第三位.由于不良的生活習(xí)慣、幽門(mén)螺桿菌感染等,2020年全球新增病例1089103例,死亡768793例[1].雖然分子診斷技術(shù),手術(shù)和輔助治療技術(shù)等方面在不斷進(jìn)步,但胃癌患者的總生存率仍然很差,尤其是胃癌晚期患者,5年生存率低于20%[2,3].因此,更好地了解胃癌發(fā)生的分子機(jī)制,識(shí)別新的生物標(biāo)志物,對(duì)提高胃癌的早期診斷和治療水平至關(guān)重要.鐵死亡是一種以脂質(zhì)過(guò)氧化與活性氧的積累為特征的鐵依賴程序性細(xì)胞死亡[4].近年來(lái),鐵死亡逐漸成為一種極具前景的誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的治療方法[5].有研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡與腫瘤的預(yù)后相關(guān),如在肝細(xì)胞癌中已經(jīng)建立一個(gè)鐵死亡相關(guān)預(yù)后基因模型[6].在胃癌中,發(fā)現(xiàn)半胱氨酸雙加氧酶1(cysteine dioxygenase 1,COD1)[7]和花生四烯酸15-脂氧合酶(arachidonic acid 15-lipoxygenase,ALOX15)[8]可促進(jìn)人胃癌細(xì)胞鐵死亡,而硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-coa desaturease1,SCD1)[9]、脂肪細(xì)胞分化相關(guān)蛋白2(adipocyte differentiation associated protein 2,PLIN2)[10]和生長(zhǎng)分化因子15(growth and differentiation factor 15,GDF15)[11]則相反.但這些鐵死亡相關(guān)基因是否與胃癌患者預(yù)后相關(guān),仍值得我們探索.因此,在本研究中,我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了鐵死亡相關(guān)基因差異表達(dá)的預(yù)后模型,同時(shí)進(jìn)行腫瘤免疫微環(huán)境分析,以探討潛在的機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料 獲取基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床信息:從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載胃癌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床數(shù)據(jù).我們獲得32例癌旁組織及375例癌組織的mRNA數(shù)據(jù).同時(shí),我們獲取了375例胃癌患者的臨床信息,包括生存時(shí)間、生存狀態(tài)、性別、年齡、腫瘤分級(jí)、病理分期.從FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)獲取鐵死亡相關(guān)基因列表,最終得到245個(gè)鐵死亡相關(guān)mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)[12].從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE62254與GSE34942數(shù)據(jù)集,分別有300例胃癌組織的mRNA數(shù)據(jù)和56例胃癌組織的mRNA數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床生存數(shù)據(jù).

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)的預(yù)處理:首先對(duì)胃癌患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選:(1)排除胃癌患者中缺乏生存時(shí)間或生存時(shí)間為0的數(shù)據(jù);(2)排除胃癌患者中缺乏完整臨床信息的病例;(3)排除病理診斷為非胃腺癌的病例;(4)排除同時(shí)有其他惡性腫瘤的病例.經(jīng)過(guò)篩選我們?cè)赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)中得到347例具有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及生存預(yù)后資料的胃癌樣本,進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的構(gòu)建.進(jìn)一步選擇TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中306例具有完整臨床相關(guān)資料的胃癌樣本,用于相關(guān)預(yù)后臨床風(fēng)險(xiǎn)因素的分析.

1.2.2 預(yù)后模型的建立:首先使用“l(fā)imma”包進(jìn)行差異分析,得到胃癌中鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),篩選條件為:錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)＜0.05和|log2差異倍數(shù)(fold change,FC)|≥1.對(duì)347例有生存資料的胃癌患者進(jìn)行單因素cox回歸分析,評(píng)估鐵死亡相關(guān)mRNA的預(yù)后價(jià)值(篩選條件為P＜0.05).我們把DEGs與具有預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)mRNA取交集,得到具有預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)DEGs.隨后使用Lasso回歸對(duì)有預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)DEGs進(jìn)行進(jìn)一步篩選并構(gòu)建預(yù)后模型.根據(jù)每個(gè)mRNA的表達(dá)水平及其相應(yīng)的回歸系數(shù)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分.風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=(mRNA1系數(shù)×mRNA1的表達(dá)量)+(mRNA2系數(shù)×mRNA2的表達(dá)量)+…+(mRNAn系數(shù)×mRNAn的表達(dá)量).根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值,將胃癌患者分為高危組與低危組.應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線來(lái)比較其之間的生存率(overall survival,OS).使用“survivalROC”包進(jìn)行時(shí)間依賴的受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析來(lái)評(píng)估模型的可信度.最后我們使用單因素和多因素cox回歸分析將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床信息結(jié)合起來(lái)評(píng)估與患者預(yù)后的關(guān)系,識(shí)別獨(dú)立預(yù)后因素.

1.2.3 免疫分析與基因表達(dá):使用“gsva”包中的單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)計(jì)算16種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)評(píng)分和13種免疫相關(guān)通路的活性[13].此外,還從先前的文獻(xiàn)中檢索了潛在的免疫檢查點(diǎn).

1.2.4 外部數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證:使用“sva”包合并GSE62254與GSE34942數(shù)據(jù)集并進(jìn)行去批次化,得到一個(gè)具有356例具有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及生存預(yù)后資料的胃癌樣本.以同樣的回歸系數(shù)(coef值)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的構(gòu)建來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用R語(yǔ)言(4.0.2版)、Bioconductor軟件包、相關(guān)R語(yǔ)言軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,模型構(gòu)建等.正態(tài)和非正態(tài)分布變量分別采用不成對(duì)t檢驗(yàn)和Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行分析.P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 胃癌中鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá) 首先我們把從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)下載的鐵死亡相關(guān)基因取交集,得到245個(gè)鐵死亡相關(guān)mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù).然后,進(jìn)行胃癌與癌旁組織的差異分析,得到50個(gè)鐵死亡相關(guān)DEGs(表1).接下來(lái)把347例TCGA數(shù)據(jù)集中245個(gè)鐵死亡相關(guān)的mRNA進(jìn)行單因素cox回歸分析,得到25個(gè)與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)mRNA(表2).把得到的50個(gè)鐵死亡相關(guān)DEGs與25個(gè)有預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)mRNA取交集,得到7個(gè)具有預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)DEGs(圖1).

圖1 TCGA隊(duì)列中鐵死亡相關(guān)基因的篩選. A:識(shí)別與生存相關(guān)的胃癌和癌旁組織之間差異表達(dá)基因的維恩圖;B:森林圖顯示了具有預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)DEGs單變量cox回歸分析的結(jié)果;C:具有預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)DEGs的相關(guān)網(wǎng)絡(luò),相關(guān)系數(shù)用不同的顏色表示.DEGs:差異表達(dá)基因.

表1 胃癌和癌旁組織差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因

表2 與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)mRNA

2.2 構(gòu)建胃癌鐵死亡相關(guān)mRNA預(yù)后模型 我們把7個(gè)具有預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)DEGs進(jìn)行Lasso回歸分析,通過(guò)交叉驗(yàn)證法進(jìn)行迭代分析,構(gòu)建出一個(gè)含有4個(gè)mRNA(DUSP1、MYB、CAV1、NOX4)的預(yù)后模型(圖2).風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的公式:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=(0.108×DUSP1的表達(dá)量)+(-0.089×MYB的表達(dá)量)+(0.036×CAV1的表達(dá)量)+(0.368×NOX4的表達(dá)量).使用上述方法我們計(jì)算了隊(duì)列中每位患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分.根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(risk score,RS)的中位值(RS=0.8331),把患者分為高危組(RS≥0.8331)與低危組(RS＜0.8331).我們發(fā)現(xiàn)隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分增加,高危組的患者死亡人數(shù)明顯多于低危組(圖3A和B).隨后進(jìn)行的主成分分析法(principal component analysis,PCA)和t-分布領(lǐng)域嵌入算法(t-distributed stochastic neighbor embedding,t-SNE)表明,不同風(fēng)險(xiǎn)組的患者分布在兩個(gè)方向上(圖3C和D).

圖2 Lasso回歸構(gòu)建預(yù)后相關(guān)模型.A:Lasso篩選變量動(dòng)態(tài)過(guò)程圖;B:交叉驗(yàn)證參數(shù)λ的選擇過(guò)程圖.

圖3 4個(gè)胃癌鐵死亡相關(guān)mRNA預(yù)后模型.A:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布曲線圖;B:胃癌患者生存狀態(tài)的分布散點(diǎn)圖;C:胃癌患者的PCA圖;D:胃癌患者的t-SNE分析圖.PCA:主成分分析法;t-SNE:t-分布領(lǐng)域嵌入算法.

2.3 生存結(jié)果分析 我們對(duì)預(yù)后模型進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析,發(fā)現(xiàn)高危組患者的OS明顯低于低危組(P＜0.001)(圖4A).接下來(lái),利用單因素與多因素cox回歸分析,確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否是OS的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因子.我們發(fā)現(xiàn)在單因素Cox回歸分析中,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與OS顯著相關(guān)[風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio,HR)=3.267,P＜0.001](表3).校正其他混雜因素后,在多變量cox回歸分析中,發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分仍然是OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(HR=3.211,P＜0.001)(表4).接下來(lái),為了驗(yàn)證預(yù)后模型的靈敏度與特異度,我們繪制了預(yù)后模型中臨床特征的ROC曲線,胃癌患者的年齡、性別、腫瘤分級(jí)、病理分期的ROC曲線下的面積(area under curve,AUC)分別為0.589、0.520、0.563、0.596,而風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC為0.644,說(shuō)明在預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后方面,預(yù)后模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分明顯優(yōu)于傳統(tǒng)臨床病理學(xué)特征(圖4B).最后,我們分析了預(yù)后模型是否可用于判斷不同臨床特征下的生存情況,對(duì)年齡(≤65和＞65)、性別(男性和女性)、腫瘤分級(jí)(G1-2和G3)、病理分期(Stage Ⅰ-Ⅱ和Stage Ⅲ-Ⅳ)進(jìn)行分層分析.我們發(fā)現(xiàn),除了在女性組中,高危組與低危組之間的生存率無(wú)明顯差別(P=0.329),其余各亞組中,低危組的OS明顯優(yōu)于高危組(P＜0.05),圖5.

圖4 4個(gè)胃癌鐵死亡相關(guān)mRNA預(yù)后模型特征.A:不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分胃癌患者的生存曲線;B:不同臨床指標(biāo)以及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)值的時(shí)間依賴性ROC曲線以及AUC值.ROC:受試者工作特征曲線;AUC:曲線下的面積.

圖5 不同臨床特征中胃癌患者的生存曲線. A:年輕患者組的Kaplan-Meier生存曲線;B:老年患者組的Kaplan-Meier生存曲線;C:女性組的Kaplan-Meier生存曲線;D:男性組的Kaplan-Meier生存曲線;E:低級(jí)別患者組的Kaplan-Meier生存曲線;F:高級(jí)別患者組的Kaplan-Meier生存曲線;G:早期患者組的Kaplan-Meier生存曲線;H:晚期患者組的Kaplan-Meier生存曲線.

表3 單因素cox回歸結(jié)果

表4 多因素cox回歸結(jié)果

2.4 免疫與基因表達(dá) 為了進(jìn)一步探索風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫狀態(tài)之間的相關(guān)性,我們使用ssGSEA量化不同免疫細(xì)胞亞群、相關(guān)功能及途徑的富集評(píng)分.我們發(fā)現(xiàn)在抗原呈遞過(guò)程中像成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、APC共抑制、APC共刺激、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體、檢查點(diǎn)、人類(lèi)白細(xì)胞抗原等的評(píng)分,在預(yù)后模型的高危組與低危組之間存在顯著差異(P＜0.05)(圖6A和B).隨著檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)的免疫療法越來(lái)越受到大家的關(guān)注,我們進(jìn)一步探索了兩組之間免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的情況.我們發(fā)現(xiàn)兩組之間在腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族(如CD40LG、CD70、TNFSF4、CD27、CD40等)、B7-CD28家族(如CD274、PDCD1LG2、PDCD1、CD276、CTLA4、ICOS等)和其他免疫檢查點(diǎn)(如LAG3、IDO2、HAVCR2等)存在差異,尤其是在高危組表達(dá)上調(diào)(圖7).

圖6 免疫細(xì)胞亞群、相關(guān)功能的關(guān)系.A:ssGSEA相關(guān)免疫細(xì)胞的表達(dá);B:免疫相關(guān)功能的表達(dá).aP＜0.05,bP＜0.01,cP＜0.001,與低危組比較.aDCs:抗原呈遞過(guò)程中像成熟樹(shù)突狀細(xì)胞;B cells:B細(xì)胞;CD8+T cells:CD8+T細(xì)胞;DCs:樹(shù)突狀細(xì)胞;iDCs:未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞;Macrophages:巨噬細(xì)胞;Mast cells:肥大細(xì)胞;Neutrophils:中性粒細(xì)胞;NK cells:NK細(xì)胞;pDCs:漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞;T helper cells:輔助性T細(xì)胞;Tfh:濾泡輔助性T細(xì)胞;Th1 cells:Th1 細(xì)胞;Th2 cells:Th2 細(xì)胞;TIL:腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞;Treg:調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;APC co inhibition:抗原提呈細(xì)胞共抑制;APC co stimulation:抗原提呈細(xì)胞共刺激;CCR:細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體;Check point:檢查點(diǎn);Cytolytic activity:細(xì)胞溶解活性;HLA:人類(lèi)白細(xì)胞抗原;Inflamation promoting:炎癥促進(jìn);MHC class Ⅰ:主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ;Parainflamation:副炎癥;T cell co inhibition:T細(xì)胞共抑制;T cell co stimulation:T細(xì)胞共刺激;Type I IFN Reponse:Ⅰ型干擾素反應(yīng);TypeⅡIFN Reponse:Ⅱ型干擾素反應(yīng).

圖7 高危組與低危組免疫檢查點(diǎn)的表達(dá). aP＜0.05,bP＜0.01,cP＜0.001,與低危組比較.HAVCR2:甲型肝炎病毒細(xì)胞受體2;CD40LG:CD40配體基因;BTNL2:嗜乳脂蛋白樣2;TNFRSF9:腫瘤壞死因子受體超家族成員9;TNFRSF9:腫瘤壞死因子受體超家族成員14;ADORA2A:腺苷A2a受體;TNFSF4:腫瘤壞死因子超家族第4成員;LAIR1:人白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體1;TNFSF14:腫瘤壞死因子超家族成員14;CD200R1:CD200受體1;PDCD1LG2:程序性死亡分子1配體2;KIR3DL1:殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體基因單體分型模式3;TNFRSF4:腫瘤壞死因子受體超家族成員4;LGALS9:可溶性半乳糖苷結(jié)合凝集素9;TNFRSF8:腫瘤壞死因子受體超家族成員8;PDCD1:程序性細(xì)胞死亡蛋白1;IDO2:吲哚胺2,3-雙加氧酶2;CTLA4:細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4;TNFRSF25:腫瘤壞死因子受體超家族成員25;TIGIT:含T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM 結(jié)構(gòu)域蛋白;BTLA:B、T淋巴細(xì)胞衰減因子;NRP1:神經(jīng)纖毛蛋白1;ICOS:可誘導(dǎo)共刺激分子;TMIGD2:受體穿膜和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域2;HHLA2:人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒-H長(zhǎng)末端重復(fù)關(guān)聯(lián)蛋白2;TNFSF18:腫瘤壞死因子超家族成員18;LAG3:淋巴細(xì)胞活化基因3.

2.5 外部數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證 我們使用相同的coef值在外部GEO數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證,同樣根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高危組與低危組.我們發(fā)現(xiàn)高危組患者的OS明顯比低危組患者差(P=0.003),這與我們?cè)赥CGA數(shù)據(jù)集中得出的結(jié)果相同(圖8A).我們進(jìn)一步構(gòu)建了預(yù)測(cè)患者1、2、3年生存的時(shí)間依賴性ROC曲線的AUC分別為0.620、0.590和0.578(圖8B).

圖8 GEO驗(yàn)證集的相關(guān)預(yù)后特征. A:驗(yàn)證集中不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分胃癌患者的生存曲線;B:驗(yàn)證集中預(yù)后模型的1、2、3年生存的時(shí)間依賴性ROC曲線.ROC:受試者工作特征曲線;AUC:曲線下的面積.

3 討論

在本次研究中,我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了與鐵死亡相關(guān)基因的預(yù)后模型.然后我們進(jìn)一步探討腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫檢查點(diǎn)抑制劑在胃癌的作用.

首先,我們綜合分析了鐵死亡相關(guān)基因在胃癌中的表達(dá)并構(gòu)建了可以預(yù)測(cè)患者生存狀態(tài)的4-mRNA預(yù)后模型.通過(guò)預(yù)后模型,我們可以明顯的發(fā)現(xiàn)高危組患者的生存率比低危組差.同時(shí),基于單因素與多因素cox回歸結(jié)果,4-mRNA預(yù)后模型(DUSP1、MYB、CAV1、NOX4)可以獨(dú)立預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后.雙特異性磷酸酶1(dual specificity phosphatase-1,DUSP1),也稱(chēng)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1 (mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1K),是雙特異性磷酸酶的原型成員,在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)家族的功能方面發(fā)揮著作用,調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、周期阻滯和細(xì)胞凋亡[14,15].在人胰腺癌細(xì)胞中,DUSP1的表達(dá)與活性通過(guò)erastin和RSL3以細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)依賴的方式增加,隨后形成抑制自噬依賴性鐵死亡反饋機(jī)制[16].DUSP1可能通過(guò)阻斷unc-51樣自噬激活蛋白激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)或BECN1的磷酸化來(lái)限制自噬小體的形成.因此抑制DUSP1可能為鐵死亡治療誘導(dǎo)提供新的可能性.而且,DUSP1與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān),在人卵巢癌細(xì)胞中,DUSP1過(guò)表達(dá)通過(guò)p38 MAPK介導(dǎo)的p-糖蛋白導(dǎo)致對(duì)紫杉醇的耐藥[17].在人胃癌細(xì)胞中,DUSP1高表達(dá)會(huì)增加對(duì)阿帕替尼的耐藥性[18].如果DUSP1表達(dá)降低,腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性降低,使腫瘤細(xì)胞具有更高的敏感性.MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)是一種原癌基因蛋白,與活性氧(reactive oxygen species,ROS)的改變相關(guān)[19].在胃癌細(xì)胞中,抑制c-MYB可以抑制COD1的轉(zhuǎn)錄,從而增加谷胱甘肽(glutathione,GSH)的生成,阻止ROS的生成,最后抑制erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[7].且有研究表明c-Myb可以通調(diào)節(jié)髓性鋅指1(一種調(diào)節(jié)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子)來(lái)調(diào)節(jié)鐵相關(guān)細(xì)胞活性和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[20].窖蛋白-1(Caveolin-1,CAV1)是一種細(xì)胞表面的穴樣內(nèi)陷中的主要蛋白,在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著重要作用,具有抗凋亡潛力,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力,增加化療耐藥性[21].在人胃癌細(xì)胞中,CAV1通過(guò)激活WNT信號(hào)通路和間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal to epithelial transition factor,MET)-人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)串?dāng)_來(lái)增加胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[22].而且CAV1的表達(dá)與進(jìn)行根治性胃切除術(shù)后患者的不良預(yù)后明顯相關(guān),可能靶向CAV1是治療胃癌的潛在選擇[23,24].還原型輔酶Ⅱ氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)是NOX家族的成員,是一種致癌因子,參與免疫調(diào)節(jié).NOX4的高表達(dá)會(huì)產(chǎn)生ROS并激活膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(glioma-associated oncogene 1,GLI1)信號(hào),促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[25].而且,高等人[26]發(fā)現(xiàn)NOX4在胃癌組織中表達(dá)升高,通過(guò)Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄信號(hào)通路激活劑參與胃癌細(xì)胞粘附和侵襲.與我們的結(jié)果一致,我們發(fā)現(xiàn)與正常組織相比,胃癌組織中的NOX4 mRNA顯著上調(diào).Lee等人[27]提出NOX4可以作為預(yù)測(cè)胃癌患者手術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)后基因之一.同時(shí),有研究表明抑制NOX4會(huì)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞在腫瘤中的浸潤(rùn),提高免疫治療的療效[28].盡管這些基因與胃癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),但將它們結(jié)合起來(lái)作為鐵死亡相關(guān)基因在胃癌患者預(yù)后的相關(guān)研究較少,因此我們此次的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的診斷與治療提供一個(gè)建議.

同時(shí),在我們的研究中,高危組的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平較高,如巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞.有研究表明[29],腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān),會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[30]、侵襲[31]、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸[32]等.在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過(guò)TGFβ2/NF-κB/Kindlin-2 axis軸參與胃癌的進(jìn)展[33].巨噬細(xì)胞來(lái)源的miR-21可以通過(guò)下調(diào)第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten,PTEN)抑制細(xì)胞凋亡及胃癌細(xì)胞順鉑耐藥,增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活[34].肥大細(xì)胞水平升高會(huì)抑制T細(xì)胞免疫及促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng),并且可以獨(dú)立預(yù)測(cè)胃癌患者的生存率[35].腫瘤浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞也可以抑制正常T細(xì)胞免疫,與胃癌患者較差的生存相關(guān)[36].而且,高危組人群有著高水平的Ⅱ型干擾素反應(yīng),會(huì)導(dǎo)致抗腫瘤免疫的減弱.我們推測(cè),胃癌患者的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平較高導(dǎo)致的腫瘤免疫增強(qiáng)和抗腫瘤免疫的減弱導(dǎo)致預(yù)后不良.鐵死亡的誘導(dǎo)與免疫檢查點(diǎn)抑制劑相結(jié)合顯示出協(xié)同增強(qiáng)的抗腫瘤活性,即使在免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗性腫瘤中[37].如B和T淋巴細(xì)胞衰減蛋白(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)是TNF超家族的成員,其表達(dá)與癌癥侵襲性有關(guān)[38].甲型肝炎病毒細(xì)胞受體2(hepatitis A virus cellular receptor 2,HAVCR2)主要位于自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,抑制抗腫瘤免疫的激活[39].本次的研究為未來(lái)進(jìn)一步研究提供了方向.

4 結(jié)論

鐵死亡是一種新的細(xì)胞死亡形式,有望為腫瘤治療提供一種新的途徑.這項(xiàng)研究有一些局限性.我們的模型是通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的回顧性數(shù)據(jù)構(gòu)建和驗(yàn)證的,需要進(jìn)一步的前瞻性研究來(lái)驗(yàn)證其臨床價(jià)值.其次,應(yīng)該進(jìn)行鐵死亡實(shí)驗(yàn)性研究來(lái)進(jìn)一步揭示潛在機(jī)制.我們篩選了用于胃癌預(yù)后的鐵死亡相關(guān)生物標(biāo)志物,為胃癌的治療提供了一定的理論基礎(chǔ).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,我國(guó)胃癌發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì).雖然隨著手術(shù)、化療、靶向及免疫治療等方式取得了進(jìn)展,胃癌患者的生存期有所延長(zhǎng),但大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期,預(yù)后差.因此,尋找新的胃癌的標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn),研究其在胃癌中的分子機(jī)制具有重要意義.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

鐵死亡是一種新型的調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡形式,探討鐵死亡相關(guān)基因在胃癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

采用生物信息學(xué)的方法來(lái)構(gòu)建鐵死亡相關(guān)基因的預(yù)后模型,評(píng)估其作為胃癌患者預(yù)后分子標(biāo)志物的可行性.

實(shí)驗(yàn)方法

通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)與胃癌生存預(yù)后之間的關(guān)系,構(gòu)建預(yù)后模型,應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析不同風(fēng)險(xiǎn)組之間對(duì)胃癌患者的影響,同時(shí)進(jìn)行全面科學(xué)的驗(yàn)證和評(píng)價(jià).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

構(gòu)建了一個(gè)含有4個(gè)mRNA(DUSP1、MYB、CAV1、NOX4)的預(yù)后模型,生存分析顯示高危組與胃癌預(yù)后不良相關(guān),且風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo),同時(shí)找到了潛在的治療靶點(diǎn).基于鐵死亡相關(guān)基因構(gòu)建的預(yù)后模型具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

鐵死亡相關(guān)mRNAs預(yù)后模型與胃癌的預(yù)后密切相關(guān),對(duì)胃癌的預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)意義并提供了潛在的治療靶點(diǎn).

展望前景

鐵死亡相關(guān)mRNAs預(yù)后模型可以作為一種潛在的生物標(biāo)記物來(lái)識(shí)別高危胃癌患者,有希望成為胃癌預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)和新的治療靶點(diǎn).