王湘君 陳 文 蘇海英

①海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院，兩棲爬行動(dòng)物研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室②南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ③海南熱帶海洋學(xué)院海洋科學(xué)技術(shù)學(xué)院

國(guó)內(nèi)兩棲爬行動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)研究，通常采用線粒體基因片段。目的：為研究核基因片段在海蛇分子系統(tǒng)學(xué)中的可行性。方法：搜索并下載NCBI上所有海蛇RAG1基因序列。運(yùn)用Mega軟件比對(duì)后，建立MrBayes系統(tǒng)聚類樹。結(jié)果：結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)庫(kù)中共包括2亞科6屬41種的RAG1序列，系統(tǒng)發(fā)育樹支持率不高，部分分支不清晰；中國(guó)產(chǎn)的5個(gè)單屬單種都應(yīng)隸屬于真海蛇屬，海蛇的親緣關(guān)系與地域關(guān)系不明顯。結(jié)論：建議RAG1基因與線粒體基因聯(lián)合建樹，并更新《中國(guó)動(dòng)物志》。

1 前言

海蛇肉營(yíng)養(yǎng)蛋白高、滋味鮮美、食之強(qiáng)身健體。鮮食或加工罐頭食品均可，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。

海蛇亞科Hydrophiinae和扁尾海蛇亞科Laticaudinae，與眼鏡蛇亞科Elapinae相似，具有前溝牙的毒蛇。尾側(cè)扁如槳，軀干后部亦略側(cè)扁[1]。

多數(shù)海蛇聚集在北大洋洲和南亞半島之間，比如環(huán)紋海蛇、長(zhǎng)吻海蛇、青環(huán)海蛇和青灰海蛇等幾種海蛇發(fā)現(xiàn)于溫帶水域。

中國(guó)沿海分布著長(zhǎng)吻海蛇、黑頭海蛇、平頦海蛇、扁尾海蛇、環(huán)紋海蛇、半環(huán)扁尾海蛇、青環(huán)海蛇、淡灰海蛇、青灰海蛇、小頭海蛇、棘眥海蛇、海蝰、藍(lán)灰扁尾海蛇、龜頭海蛇、棘鱗海蛇等l5種扁尾海蛇亞科和海蛇亞科。這些海蛇主要生存南海、北部灣以及瓊、臺(tái)、粵、桂和閩等沿海區(qū)域，長(zhǎng)吻海蛇分布于中國(guó)沿海省份[2]。

通過(guò) DNA 分子標(biāo)記技術(shù)研究蛇類親緣關(guān)系和進(jìn)化地位，對(duì)蛇類資源的科學(xué)評(píng)估和保護(hù)及開發(fā)利用都有重要意義[3-5]，但國(guó)內(nèi)都是基于線粒體基因的進(jìn)化樹分析。

重組激活蛋白基因（recombination activating gene，RAG）是脊椎動(dòng)物內(nèi)特有的一類基因，在脊椎動(dòng)物T細(xì)胞受體和免疫血球素基因的重排與重組過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色[6]。RAGs，尤其是RAG1，具有進(jìn)化緩慢，第3位密碼子變化最小，不同物種之間的堿基組成近乎恒定等一些適于用來(lái)研究系統(tǒng)發(fā)育的特點(diǎn)[7]。

該基因作為脊椎動(dòng)物特異性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵基因，國(guó)內(nèi)已經(jīng)應(yīng)用于魚類[8-11]和鳥類[12]多個(gè)物種 DNA 水平上的序列分析。國(guó)外也成功運(yùn)用于兩棲類[13]和爬行類[14]的分子系統(tǒng)樹的建立。

本實(shí)驗(yàn)研究旨在通過(guò)比較分析2亞科6屬41種的 RAG1 序列，構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，探討該基因建樹的可行性，并初步分析海蛇的系統(tǒng)關(guān)系。

2 材料與方法

研究材料及方法如下所示。

從NCBI搜索所有海蛇RAG1基因序列，若某個(gè)物種的序列多于5條，則最多保留5條，根據(jù)序列號(hào)，盡量保留不同來(lái)源的數(shù)據(jù)，共下載海蛇亞科和扁尾海蛇亞科6屬41種78條序列。

表1 從GenBank下載的RAG1序列旋海蛇

下載序列存為fasta文件并輔以手動(dòng)校正，進(jìn)而序列放進(jìn)MEGA7.0進(jìn)行校對(duì)。通過(guò)基因序列數(shù)據(jù)處理后應(yīng)用Java（Sequence Matrix）構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)樹，采用標(biāo)準(zhǔn)模型，300萬(wàn)代收斂，約6h收存。

同樣的模型，換用計(jì)算服務(wù)器平臺(tái)由重慶有線電視網(wǎng)絡(luò)股份有限公司提供云計(jì)算環(huán)境，36VCPU，32G內(nèi)存，13min完成收樹。

3 結(jié)果與分析

如圖，海蛇亞科（Hdrophiinae）6屬41個(gè)物種，多物種混為一支，扁尾海蛇亞科（Laticaudinae）)同種個(gè)體聚集趨勢(shì)明顯，同物種除海蛇屬相應(yīng)分支支持率均低于40%。整體樹總體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不清晰。有個(gè)別不清晰點(diǎn)為物種名有變動(dòng)，此樹建樹時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且多物種混為一支無(wú)法應(yīng)用。

物種名有變動(dòng)點(diǎn)：Polyodontognathuscaerulescens現(xiàn)用名Hydrophiscaerulescens、Microcephalophisgracilis現(xiàn)用名Hydrophisgracilis、Leioselasma elegans現(xiàn)用名Hydrophis elegans。

圖1 RAG1貝葉斯系統(tǒng)聚類樹

3.1 扁尾海蛇屬

從樹上可以看出，扁尾海蛇屬（Laticauda）并未聚為一支。其中，扁尾海蛇（L.laticaudata）和額扁尾海蛇（L.frontalis）親緣關(guān)系非常近，兩者與外群眼鏡蛇（Najanaja）聚為一支，處于系統(tǒng)發(fā)育樹的根部。而藍(lán)灰扁尾海蛇（L.Colubrina）形成時(shí)間略晚，在劍尾海蛇屬大支之后，其它海蛇之前。此分支點(diǎn)的支持率高達(dá)99%。

3.2 真海蛇屬

絕大多數(shù)真海蛇聚為一個(gè)大支。其中斯里蘭卡海蛇（Hydrophislapemoides）和細(xì)頸海蛇（H.coggeri）聚成的小支分化時(shí)間相對(duì)最早。其它真海蛇形成11個(gè)分支。

第一分支中，小頭海蛇（H.gracilis）和青灰海蛇（H.Caerulescens）親緣關(guān)系最近，再與印度洋平頦海蛇（H.curtus）聚為一小支。青環(huán)海蛇（H.cyanocinctus）位于另一小支。均為中國(guó)海域發(fā)現(xiàn)的物種，除青灰海蛇外，都曾發(fā)現(xiàn)于南海海域。

第二分支中，印度洋平頦海蛇（H.curtus）和棘眥海蛇（H.peronii）交錯(cuò)聚成一小支，印度洋平頦海蛇明顯不呈單系。另一小支中，螺旋海蛇（H.spiralis）鑲嵌于裂頦海蛇（H.schistosus）之中，再與南越海蛇（H.parviceps）匯聚。

第三分支中，另一條螺旋海蛇（H.spiralis）和白氏海蛇（H.belcheri）親緣關(guān)系最近，再與棘鱗海蛇（H.stokesii ）匯聚，但棘鱗海蛇不呈單系。

第四分支中，孟加拉海蛇（H.stricticollis）和黑尾海蛇（H.viperinus）親緣關(guān)系最近，再與印澳海蛇（H.elegans）匯聚，金氏海蛇（H.kingii）相對(duì)最原始。

第五分支中，大海蛇（H.major）和細(xì)頸海蛇（H.coggeri）親緣關(guān)系近，太平洋海蛇（H.pacificus）和淡灰海蛇（H.ornatus）親緣關(guān)系近。

第六分支中包括：沙撈越海蛇（H.brooki）、麥?zhǔn)虾Ｉ撸℉.macdowelli）、截吻海蛇（H.jerdonii）。但麥?zhǔn)虾Ｉ卟怀蕟蜗怠?/p>

第七分支中，青環(huán)海蛇（H.cyanocinctus）相對(duì)最原始。麥?zhǔn)虾Ｉ撸℉.macdowelli）鑲嵌于長(zhǎng)吻海蛇（H.platurus）之中，兩者與另一條淡灰海蛇（H.ornatus）匯聚，再與松達(dá)斑海蛇（H.obscurus）匯聚成一個(gè)小支。而黑頭環(huán)紋海蛇（H.atriceps）和另一條青環(huán)海蛇（H.cyanocinctus）匯聚于另一小支。

第八分支中，淡灰海蛇（H.ornatus）與厚尾海蛇（H.pachycercos）親緣關(guān)系近，松達(dá)斑海蛇（H.obscurus）麥?zhǔn)虾Ｉ撸℉.macdowelli）親緣關(guān)系近。

第九分支僅包括一條太平洋海蛇（H.pacificus）和一條斯里蘭卡海蛇（H.lapemoides）。

第十分支中，一條長(zhǎng)吻海蛇（H.platurus）和一條太平洋海蛇（H.pacificus）鑲嵌于茲韋費(fèi)爾海蛇（H.zweifeli）之中，茲韋費(fèi)爾海蛇不呈單系。

第十一分支中，環(huán)紋海蛇（H.fasciatus）和黑頭環(huán)紋海蛇（H.atriceps）親緣關(guān)系近，再與茲韋費(fèi)爾海蛇（H.zweifeli）和太平洋海蛇（H.pacificus）聚為一小支；另一小支包括一條斯里蘭卡海蛇（H.lapemoides）和一條細(xì)頸海蛇（H.coggeri）。

3.3 其它海蛇

劍尾海蛇屬大支明顯形成兩個(gè)分支。其中，劍尾海蛇屬（Aipysurus）和龜頭海蛇屬（Emydocephalus）聚為一支。但龜頭海蛇（E.annulatus）嵌于多種劍尾海蛇之中，劍尾海蛇屬未成單系。

杜氏劍尾海蛇（A.duboisii）和短鼻劍尾海蛇（A.apraefrontalis）親緣關(guān)系很近；龜頭海蛇（E.annulatus）與欖綠劍尾海蛇（A.laevis）親緣關(guān)系很近，龜頭海蛇鑲嵌于三條欖綠劍尾海蛇之中。以上四種蛇聚為一小支。

而尖尾海蛇（A.eydouxii）和灰刺尾海蛇（A.fuscus）親緣關(guān)系很近，聚為另一小支。真海蛇屬中的唐納德海蛇（Hydrophisdonaldi）也鑲嵌其中。

在劍尾海蛇屬大支的另一分支中，包括兩個(gè)單屬單種，即達(dá)爾文海蛇（Hydrelapsdarwiniensis）和異海蝰（Parahydrophismertoni）。

4 討論

4.1 分支問(wèn)題

細(xì)頸海蛇（H.coggeri）、印度洋平頦海蛇（H.curtus）、棘鱗海蛇（H.stokesii ）、麥?zhǔn)虾Ｉ撸℉.macdowelli）、長(zhǎng)吻海蛇（H.platurus）、淡灰海蛇（H.ornatus）、青環(huán)海蛇（H.cyanocinctus）、松達(dá)斑海蛇（H.obscurus）、太平洋海蛇（H.pacificus）、斯里蘭卡海蛇（H.lapemoides）、茲韋費(fèi)爾海蛇（H.zweifeli）、黑頭環(huán)紋海蛇（H.atriceps）和欖綠劍尾海蛇（A.laevis），共13個(gè)物種不呈單系。

運(yùn)用細(xì)胞核基因RAG1基因建樹，約1/3的多條序列的蛇類，同一物種并未聚為一支，與線粒體基因建樹研究結(jié)果相似，但其有爭(zhēng)議的物種數(shù)比例明顯高于線粒體基因[15]。

許多分支支持率并不高，且并未形成二岔分化。可見核基因單獨(dú)使用，聚類效果不清晰。但考慮到海蛇研究起步晚，物種鑒定尚不成熟，作者暫時(shí)建議，核基因建樹需要聯(lián)合線粒體基因，以提高支持率。

4.2 分類問(wèn)題

從系統(tǒng)樹上可以看出，《中國(guó)動(dòng)物志》上記載的5個(gè)單屬單種，棘眥海蛇（Acalyptophisperonii）、棘鱗海蛇（Astrotiastokesii）、截吻海蛇（Keriliajerdonii）、長(zhǎng)吻海蛇（Pelamis platurus）和海蝰（Praescutataviperina），都鑲嵌于真海蛇屬（Hydrophis）大支之中。這與全球海蛇分布最多的國(guó)家澳大利亞的研究一致[16]。作者建議，中國(guó)需要重新修訂工具書《動(dòng)物志》，某些屬、種的命名應(yīng)參考國(guó)際國(guó)內(nèi)最新的研究成果。

由圖可知，斯里蘭卡海蛇和細(xì)頸海蛇、小頭海蛇和青灰海蛇、印度洋平頦海蛇和棘眥海蛇、裂頦海蛇和南越海蛇、白氏海蛇與棘鱗海蛇、孟加拉海蛇和黑尾海蛇、印澳海蛇和金氏海蛇、沙撈越海蛇和截吻海蛇、淡灰海蛇與厚尾海蛇，以及杜氏劍尾海蛇和短鼻劍尾海蛇、尖尾海蛇和灰刺尾海蛇、額扁尾海蛇和扁尾海蛇，都有著較近的親緣關(guān)系。

4.3 分布問(wèn)題

同屬蛇類的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，往往與地域遠(yuǎn)近相關(guān)[17,18]。但海蛇的地域遷徙路線阻礙相對(duì)較少，其活動(dòng)范圍普遍大于陸地蛇類。從系統(tǒng)樹上可以看出，真海蛇屬除第一分支的蛇類在中國(guó)海域均有分布；除第第九分支外，其余9個(gè)分支，都有1-2和物種在中國(guó)海域有記載。

而中國(guó)南海海域所產(chǎn)的8個(gè)物種中，除黑頭海蛇（H.melanocephalus）外，其余7個(gè)物種的RAG1基因在NCBI上均有序列。長(zhǎng)吻海蛇（H.platurus）位于第七、第十分支，平頦海蛇（H.curtus）位于第一、第二分支；青灰海蛇（H.caerulescens）位于第一分支，青環(huán)海蛇（H.cyanocinctus）位于第一、第七分支，環(huán)紋海蛇（H.fasciatus）位于第七、第十一分支，小頭海蛇（H.gracilis）位于第一分支，淡灰海蛇（H.Ornatus）位于第五、第七、第八分支?？梢?，即使同屬，南海的海蛇在系統(tǒng)樹上并未聚集。

5 結(jié)論

RAG1基因在NCBI上包括的物種多，可以運(yùn)用于分子系統(tǒng)學(xué)建樹，但建議與線粒體基因聯(lián)合建樹。

本研究與國(guó)際研究一致，5個(gè)單屬單種（棘眥海蛇、棘鱗海蛇、截吻海蛇、長(zhǎng)吻海蛇和海蝰）的分類地位應(yīng)重新界定，建議更新《中國(guó)動(dòng)物志》。

據(jù)目前的研究來(lái)看，同屬海蛇的分布區(qū)域，與親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，沒(méi)有明顯的相關(guān)性。