王致和，馬金慧，張亞萍，杜雷超，牛曉琳，謝忠清

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅武威 733006；2.古浪縣黃花灘鎮(zhèn)人民政府，甘肅古浪 733102）

0 引言

甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）原產(chǎn)南美洲巴拉圭、巴西，為亞熱帶多年生草本植物。作為新興的糖料作物，近年來在江蘇、安徽、山東、新疆等省得到了大面積推廣種植。甘肅河西地區(qū)年種植面積達(dá)1.3 萬hm2，主要通過種子育苗、扦插育苗進(jìn)行種苗的培育。由于甜葉菊屬于短日照作物，不能在河西地區(qū)自然采收種子，引進(jìn)的生產(chǎn)用種質(zhì)量極不穩(wěn)定，可能是經(jīng)過連續(xù)多年自產(chǎn)自繁的混交種子，并且這種混交種子的種性退化，嚴(yán)重影響甜葉菊原料的品質(zhì)，因此甜葉菊種子成為制約甜葉菊進(jìn)一步發(fā)展亟待解決的關(guān)鍵問題。

甜葉菊花序?qū)兕^狀無限花序，自花不孕，種子細(xì)小，成熟度差異較大，發(fā)芽率低；屬于對光照敏感性強(qiáng)的短日照植物，臨界日長為12 h，最佳生長時期為100～120 d。在河西高緯度地區(qū)的自然氣候條件下不能開花結(jié)實或開花晚，早霜來臨時種子很少成熟，種子發(fā)芽率低，生產(chǎn)用種只能依靠從安徽、江蘇等地引進(jìn)。目前，在甜葉菊種子方面的研究，時俠清等[1]進(jìn)行了甜葉菊種子的形態(tài)觀察與品種比較，袁柳鎏等[2]進(jìn)行了聚藥雄蕊植物甜葉菊花部特征與繁育特性初步研究，顧忠斌等[3]進(jìn)行了河西走廊地區(qū)甜葉菊蜂窩狀紙筒育苗技術(shù)研究，程曉紊等[4]對甜葉菊三倍體培育及其農(nóng)藝性狀進(jìn)行了分析，劉傳倫等[5]對甜葉菊種子繁育技術(shù)進(jìn)行了探討，劉紅光[6]對甜葉菊種子優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)繁育技術(shù)進(jìn)行了研究，秦新惠[7]研究了河西地區(qū)甜葉菊制種技術(shù)。但是在高緯度地區(qū)甜葉菊制種方面的研究幾乎是空白。為此，我們開展了甜葉菊短日照雜交制種技術(shù)研究，擬探索高緯度地區(qū)甜葉菊制種技術(shù)、解決北方地區(qū)甜葉菊原料生產(chǎn)使用優(yōu)質(zhì)的F1代雜交種的關(guān)鍵技術(shù)問題，為種植戶提供優(yōu)良的甜葉菊生產(chǎn)用種，為推動河西地區(qū)甜葉菊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗設(shè)在甘肅省武威市涼州區(qū)，位于東經(jīng)101°59′～103°23′，北緯37°23′～38°12′，地處甘肅省西北部，河西走廊東端，祁連山北麓，平均海拔1 632 m。涼州區(qū)水資源分布于石羊河中上游地區(qū)，地表水、地下水總的可利用量多年平均為9.616 億m3。年平均降水量100 mm，年蒸發(fā)量2 020 mm；年平均溫度7.7 ℃，晝夜溫差平均7.9 ℃，氣溫以7 月最高，為29 ℃，1 月最低，為-14.9 ℃。全年無霜期143 d 左右，日照時數(shù)2 873.4 h，日照百分比為67%；太陽輻射量為138.45 千卡/cm2，為太陽輻射量高值區(qū)。屬溫帶大陸干旱氣候，具有干旱少雨、日照充足、晝夜溫差大的特點。有利于農(nóng)作物干物質(zhì)的積累，特別是適于甜葉菊等糖料作物糖分的積累，是甜葉菊種植的理想地區(qū)。

1.2 供試品種

供試品種從歷年選擇的優(yōu)良單株中，選配組合，盡量從遠(yuǎn)源系譜中選擇產(chǎn)量高、總苷含量高、RA 苷含量高、抗性強(qiáng)、花期相近、結(jié)實率高的兩個優(yōu)良株系組合進(jìn)行雜交制種。本試驗父母本來源于無性扦插繁殖的‘甘引1 號’穩(wěn)定株系和‘甘引4 號’穩(wěn)定株系；普通甜葉菊種子‘惠農(nóng)3 號’為對照（由安徽蚌埠惠農(nóng)甜葉菊科技有限公司提供）；由‘甘引1號’和‘甘引4號’分別做父母本雜交制種的F1代雜交種。

1.3 主要儀器

顯微攝像系統(tǒng)（尼康Ni-U），佳能數(shù)碼相機(jī)（佳能EOS6D），高效液相色譜儀（Waters-600E-248），紫外—可見分光光度計（T6S），電子分析天平（島津AEG-220），高速離心機(jī)（HR/T20M）。

1.4 試驗方法

1.4.1 甜葉菊種子的形態(tài)特征及開花結(jié)實習(xí)性的觀察

參照袁鎏柳等方法[2]，在盛花期，選取發(fā)育進(jìn)程基本一致的頭狀花序30 個進(jìn)行標(biāo)記并定點觀測，分別于每天9:30—11:30 和15:30—16:30 觀察2 次。小花開放前記錄花冠筒長度、花冠筒顏色、小花開放時間，小花開放后記錄柱頭伸長情況、授粉生物訪花情況、柱頭和花瓣萎蔫情況等。并測定種子植物學(xué)特征。

1.4.2 甜葉菊短日照處理雜交制種技術(shù)

以無性扦插繁殖的‘甘引1 號’穩(wěn)定株系、‘甘引4 號’穩(wěn)定株系、雜交種和普通種子做品種比較試驗。采取隨機(jī)區(qū)組進(jìn)行試驗設(shè)計，將選定的父、母本優(yōu)良株系進(jìn)行無性繁殖，采用扦插育苗的方法，將兩個親本分片扦插，苗高10～12 cm，7～8 對真葉，苗齡達(dá)到50 d，4 月下旬氣溫穩(wěn)定到10 ℃時即可定植。定植地選擇在建好的拱形溫棚，土地準(zhǔn)備工作及覆膜與甜葉菊大田種植相同。移栽時分別將兩個不同的甜葉菊親本株系定植在同一拱形棚，以利于甜葉菊父母本進(jìn)行相互雜交。1 膜4 行，父本和母本各2 行，1∶1 相間定植，株行距40 cm×20 cm，公頃定植13.5 萬～15 萬株。7 月上旬進(jìn)入生長盛期（移栽后60 d 左右），當(dāng)甜葉菊出現(xiàn)15 對葉片，株高約30 cm 時進(jìn)行遮光處理。處理的方法是，每天下午18：00 時左右，采用農(nóng)用黑色塑料布封蓋拱棚，在次日早晨8:00揭去遮光物，使甜葉菊植株每天見光時間小于10 h，連續(xù)處理20 d，到現(xiàn)蕾時停止遮光處理。甜葉菊種子成熟后冠毛呈倒傘狀張開，會借助微風(fēng)四處飄散，應(yīng)及時采收。記錄種子特征、統(tǒng)計干葉產(chǎn)量、檢測其品質(zhì)（總苷、RA苷及RA苷/總苷含量）、測定發(fā)芽情況。

1.4.3 授粉套袋

為揭示甜葉菊是否存在自發(fā)自交現(xiàn)象，以及自交親和性程度，設(shè)置了以下幾個套袋處理試驗：（1）自交套袋：去除已開放花序，保留未開放者，直接套袋，開花期輔助人工授粉；（2）人工異交授粉：將相鄰兩株父母本套袋，開花期每天上午10:00 與下午15:00 進(jìn)行人工輔助授粉各1 次；（3）異交套袋：相鄰兩株父母本直接套袋，不進(jìn)行輔助授粉；（4）異交自然授粉：父母本相鄰種植，自然狀態(tài)下授粉。果實成熟后統(tǒng)計結(jié)實率。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜葉菊花與種子的形態(tài)特征及開花結(jié)實習(xí)性的觀察

2.1.1 甜葉菊花的形態(tài)結(jié)構(gòu)及開花習(xí)性

據(jù)2016—2018 年觀察，甜葉菊先從主莖頂部開花，然后自上而下，由內(nèi)向外呈螺旋狀開放；各分枝的開花順序與主莖一致；一個花序先是中間開放，然后分別外展。甜葉菊花為兩性花，花為頭狀傘房總狀無限花序，直徑3～5 mm，總苞花萼，總苞綠色，5～6片，近等長，背面被短柔毛，一個總苞中有4～6個小花集生。小花花冠白色，5裂，喇叭口狀外展，基部聯(lián)合成筒狀，呈淡紫色或白色。小花有雄蕊5個，全著藥，花絲分離，著生于花托?；ㄋ幬挥谥^下方，圍繞花柱著生，為聚藥雄蕊。雌蕊1 個，由2 個心皮構(gòu)成，下位子房，1 室有1個胚珠，花柱細(xì)長，開花后，柱頭從花藥筒頂端小口伸出，呈“Y”形張開（圖1）。柱頭和花柱上端被包裹在花藥筒內(nèi)，形成類似合蕊柱的柱狀結(jié)構(gòu)。自花不孕，每個總苞花序可結(jié)實5～7粒種子。

圖1 甜葉菊開花與小花特征Fig.1 Flowering and floret characteristics of stevia

傳粉生物學(xué)觀測發(fā)現(xiàn)，蜜蜂經(jīng)常前來采集花粉，也常發(fā)現(xiàn)薊馬經(jīng)從花冠筒口處進(jìn)入小花內(nèi)取食花粉，偶有蝴蝶探入花冠筒內(nèi)吸食花蜜。以蜜蜂和薊馬的訪問頻率最高，蝴蝶的訪問頻率最低。

2.1.2 甜葉菊種子的植物學(xué)特征

甜葉菊種子屬瘦果，由冠毛、子實皮、種皮和胚4 部分組成。未成熟的種子冠毛閉合不展開，種子細(xì)長，外觀干秕，黃白色。成熟度好的種子，冠毛張開角度大，呈到傘狀形，果實紡錘形，種子細(xì)小，長2.9～4.3 mm，寬0.5～0.8 mm，千粒重為0.39～0.42 g（表1）。果皮黑（棕）褐色，有5～6 條凸?fàn)畎缀稚v紋，兩縱紋間有縱溝，果皮密生刺毛。果頂有淺褐色冠毛20～22 條，長5～7 mm，呈倒傘狀展開，冠毛皮上有銳刺。由于甜葉菊自花不孕，種子質(zhì)量差異大，種子不實率高，不實率一般25.3%～39.9%，成熟度77.9%～87.3%（表1），發(fā)芽率65.6%～72.3%（表2）。甜葉菊種子果皮上棱線顏色、條數(shù)與種子成熟度的關(guān)系以及種子的長度、寬度、冠毛的長度、冠毛的數(shù)量等，品種間存在差異，是否與成熟度、不同產(chǎn)地、不同年份有關(guān)系，有待研究。

表1 2016—2019 年對甜葉菊種子形態(tài)測定結(jié)果Table 1 Result of stevia seed morphometry in 2016—2019

在河西地區(qū)的夏季日照時數(shù)15 h 以上的條件下，9 月下旬現(xiàn)蕾，10 月初開花，開花授粉的胚珠經(jīng)25～30 d發(fā)育成種子，10月份氣溫較低，早霜來臨，自然結(jié)實率很低，成熟度差，難以收獲合格的種子。

2.2 甜葉菊短日照處理雜交制種效果

2.2.1 遮光處理對開花、結(jié)實的影響

甜葉菊為短日照作物，其臨界日照為12 h。在河西地區(qū)自然條件下，夏季日照長達(dá)15 h，所以開花偏晚。正常植株如不進(jìn)行人工遮光，就無法收到成熟的種子，能否正確進(jìn)行遮光處理，是制種成敗的關(guān)鍵。從4 年的遮光處理試驗結(jié)果來看（表2），甜葉菊父母本5月上旬定植，通過30～60 d的生長，7月上旬進(jìn)行遮光處理，每天下午18：00 時左右，采用農(nóng)用黑色塑料布封蓋拱棚，在次日早晨8：00 揭去遮光物，使甜葉菊植株每天見光時間小于10 h，20 d 后即7 月下旬現(xiàn)蕾，撤去黑色遮光膜。7 月下旬至8 月上旬開花，現(xiàn)蕾至開花期間日平均溫度20.8～23.5 ℃。開花后要進(jìn)行人工輔助授粉，每天上午9—10 時將相鄰開花的父母本植株輕輕往一起靠近，互相觸碰搖動即可。8 月下旬至9 月上旬種子陸續(xù)成熟，開花到種子成熟期間日平均溫度20.7～26.5 ℃。

表2 遮光處理試驗結(jié)果Table 2 Experimental results of shading treatment

種子成熟后選擇晴天無露水、無大風(fēng)的天氣，在10 點以后進(jìn)行采收種子。一般2 d 一次，采種方法是套袋搖株或使用甜葉菊種子專用采收裝置。采收的種子要注意適當(dāng)晾曬，保持干燥，除去雜質(zhì)，裝入布袋置于陰涼通風(fēng)處保存。2016—2019 年測定，平均單株收獲種子5.2～7.5 g，按收獲株數(shù)75%計每公頃產(chǎn)量可達(dá)585～844.5 kg，4 年平均發(fā)芽率為69.7%，普通甜葉菊種子平均發(fā)芽率為58.2%，發(fā)芽率提高了11.5 個百分點，對于甜葉菊種子來說是比較高的。

通過4年的短日照處理試驗可知：

甜葉菊是自交不育的異花授粉植物，甜葉菊的自然雜交率高達(dá)95%以上，致使甜葉菊不具有高度純合的基因型，實生單株在遺傳性上是異質(zhì)性很強(qiáng)的雜合體，無性繁殖是保持甜葉菊良種特性的較好方法[8]，因此，優(yōu)良單株的選擇是雜交制種的基礎(chǔ)。

甜葉菊為短日照作物，其臨界日照為12 h，在河西地區(qū)自然條件下夏季日照長達(dá)15 h，能否適當(dāng)進(jìn)行遮光處理，是制種成敗的關(guān)鍵。短日照處理應(yīng)在甜葉菊生長盛期進(jìn)行，在生長盛期進(jìn)行短日照處理的，其單株種子量就多，在未進(jìn)入生長盛期而進(jìn)行短日照處理的，單株種子量就少。因此，要做到早育苗、早移栽，促苗早發(fā)和營養(yǎng)生長，在進(jìn)行短日照處理時，甜葉菊植株高度至少應(yīng)在30 cm 以上。同時，由于從短日照處理到種子成熟需要70 d左右的時間，故處理時間應(yīng)在7月上旬前后進(jìn)行。

在甜葉菊短日照處理至現(xiàn)蕾后繼續(xù)延長處理天數(shù)的，其花期早與晚、集中與分散、成種早與晚以及單株種子量的多與少均無明顯的差異。因此，甜葉菊的現(xiàn)蕾應(yīng)視為短日照處理的終期，處理天數(shù)為20～25 d。

2.2.2 甜葉菊授粉套袋效果

套袋試驗結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，在人工輔助授粉自交套袋的情況下沒有種子生成，表明不存在自發(fā)自交，甜葉菊自交不親和，由于每個品種無性繁殖植株個體間的遺傳背景完全一致，其品質(zhì)內(nèi)自交的親和性幾乎為零。作為母本和父本分別與其他株系人工雜交都獲得了成熟飽滿的種子，在不進(jìn)行輔助授粉的自然狀態(tài)下結(jié)實率較低，因此，在甜葉菊雜交制種過程中有必要進(jìn)行人工輔助授粉，以提高種子產(chǎn)量。

表3 套袋試驗結(jié)實率Table 3 Seed setting rate of bagging test

2.2.3 甜葉菊雜交種葉子的產(chǎn)量和品質(zhì)表現(xiàn)

從表4 可以看出，雜交種和普通品種比較：葉片總苷含量2018、2019 年分別提高0.78、0.24 個百分點，平均提高0.51個百分點；RA 苷含量2018、2019年分別提高2.28、2.25 個百分點，平均提高2.27 個百分點；RA/總苷2018、2019 年分別提高12.81、14.61 個百分點，平均提高13.71 個百分點；干葉產(chǎn)量2018、2019 年分別提高11.24%、11.96%，平均提高11.60%；葉片品質(zhì)和產(chǎn)量都比普通品種有所提高。結(jié)果表明通過選育優(yōu)良單株、繁育優(yōu)良單株無性系、選配優(yōu)良組合、短日照處理繁育雜交種、試驗推廣栽培這一系列方法、技術(shù)配套使用，可以在河西地區(qū)培育甜葉菊雜交種，并且其品質(zhì)和質(zhì)量不斷提高，而且還可根據(jù)市場需求選配組合，培育甜葉菊新品種。雜交種栽培必然會取代有性栽培的普通品種和無性栽培的品種，為種植農(nóng)戶、加工企業(yè)創(chuàng)造很好的經(jīng)濟(jì)效益。

表4 2018—2019 年父母本、雜交種和普通種子的葉片產(chǎn)量與品質(zhì)檢測結(jié)果Table 4 Yield and quality test results of leaves of parents,hybrids and common seeds in 2018—2019

3 討論與結(jié)論

通過對甜葉菊花與種子的形態(tài)特征及開花結(jié)實習(xí)性的觀察發(fā)現(xiàn)，花部特征與傳粉生物學(xué)觀察與袁鎏柳等[2]的研究結(jié)果趨于一致；由于甜葉菊自花不孕，種子質(zhì)量差異大，種子不實率高，不實率一般25.3%～39.9%，成熟度77.9%～87.0%，發(fā)芽率65.6%～72.3%。甜葉菊種子果皮上棱線顏色、條數(shù)與種子成熟度的關(guān)系以及種子的長度、寬度、冠毛的長度、冠毛的數(shù)量等，品種間存在差異，是否與成熟度、不同產(chǎn)地、不同年份有關(guān)系，有待研究。

甜葉菊屬于短日照植物，對光照敏感性強(qiáng)，臨界日照為12 h，在低緯度地區(qū)栽培開花較早，在高緯度長日照地區(qū)栽培開花較遲，不能夠收獲種子。能否正確進(jìn)行遮光處理，是制種成敗的關(guān)鍵。在高緯度地區(qū)雜交制種，當(dāng)甜葉菊生長旺盛期，株高30 cm以上，進(jìn)行遮光處理，每天光照時間≤10 h，連續(xù)遮光處理天數(shù)為20 d，有利于甜葉菊提早開花；雖然蜜蜂對甜葉菊的訪問，實現(xiàn)了甜葉菊的異花授粉需求，但還需采用人工輔助授粉才可提高甜葉菊種子的結(jié)實率，提高種子產(chǎn)量和質(zhì)量；通過高緯度地區(qū)甜葉菊雜交制種技術(shù)，生產(chǎn)的雜交種子千粒重達(dá)0.39～0.42 g、發(fā)芽率達(dá)69.70%，比安徽提供的普通甜葉菊種子，千粒重提高0.08 g 左右，發(fā)芽率提高了11.5個百分點；這項研究為在高緯度地區(qū)進(jìn)行甜葉菊雜交制種奠定了基礎(chǔ)。

套袋及隔離種植試驗結(jié)果表明，甜葉菊是自交不育的異花授粉作物，其自然雜交率高達(dá)95%以上，致使甜葉菊不具有高度純合的基因型，實生單株在遺傳性上是異質(zhì)性很強(qiáng)的雜合體，群體的基因組成多屬雜合型，遺傳性不穩(wěn)定給選種工作帶來一定困難。甜葉菊遺傳上自交不親和，繁育系統(tǒng)以異交為主，自交可能性低。因此，在實際種子生產(chǎn)中選配不同的親本組合進(jìn)行異交制種。無性繁殖是保持甜葉菊良種特性的較好方法，因此，優(yōu)良單株的選擇是雜交制種的基礎(chǔ)。

甜葉菊經(jīng)適當(dāng)遮光處理其雜交種和普通品種比較：葉片總苷含量平均提高0.51 個百分點；RA 苷含量平均提高2.27個百分點；RA/總苷平均提高13.71個百分點；干葉產(chǎn)量平均提高11.60%；各項指標(biāo)都比普通品種有很大的提高。結(jié)果說明通過選育優(yōu)良單株、繁育優(yōu)良單株無性系、選配優(yōu)良組合、短日照處理繁育雜交種、試驗推廣栽培這一系列技術(shù)、方法配套使用，可以在河西地區(qū)培育甜葉菊雜交種，并且其品質(zhì)和質(zhì)量不斷提高，而且還可根據(jù)市場需求選配組合，培育甜葉菊新品種。雜交種栽培也必然會取代有性栽培的普通品種和無性栽培的品種，為種植農(nóng)戶、加工企業(yè)創(chuàng)造很好的經(jīng)濟(jì)效益。