王慶彬， 孟 慧， 彭春娥， 周大發(fā)， 耿全政，陳大印， 張 民

(1.土肥資源高效利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東蓬勃生物科技有限公司，山東泰安 271000；3.作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018；4.山東蓬創(chuàng)農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)有限公司，山東泰安 271000)

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(Plant Growth Regulators,PGRs)是一種具有與植物內(nèi)源性激素相同生理功效和相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的一類合成化合物，可以參與調(diào)控植物內(nèi)多種代謝通路，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，提高作物產(chǎn)量或提高抗逆抗病能力[1 - 3]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中該類物質(zhì)的合理施用可以顯著提高作物產(chǎn)量[4]，提高作物的肥料利用率[5]。但隨著植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用增多，其安全問題也受到廣泛關(guān)注[6]。肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不合理施用可能會(huì)造成農(nóng)作物產(chǎn)量的下降[7]，其殘留也對(duì)人體健康造成威脅[8,9]。因此，研究肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)方法成為行業(yè)熱點(diǎn)。

當(dāng)前對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)方法主要有免疫檢測(cè)[10]、色譜-質(zhì)譜[11,12]和高效液相色譜(HPLC)[13,14]等方法。HPLC法雖廣泛應(yīng)用于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量的檢測(cè)[15,16]，但鮮有檢測(cè)肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的報(bào)道[17]。目前，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法可同時(shí)檢測(cè)3～5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[18，26 - 30]。但現(xiàn)有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類繁多，常規(guī)大田使用種類在20種左右，現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法未完全涵蓋；或者需要聯(lián)合使用多種分離富集技術(shù)，涉及色譜柱多樣；或者樣品前處理復(fù)雜[19]。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)反式玉米素、赤霉素A3、水楊酸、吲哚乙酸、茉莉酸、多效唑、脫落酸、蕓苔素內(nèi)脂和胺鮮酯9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量的HPLC法。肥料樣品用超聲波輔助甲醇提取，有效去除樣品中的干擾物類，利用230 nm和260 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)，拓寬了檢測(cè)范圍。本方法檢出限及精確度與標(biāo)準(zhǔn)方法相比并沒有降低，為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑行業(yè)規(guī)范的制定和在農(nóng)作物上的施用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀(日本，島津公司)，配紫外檢測(cè)器；Centrifuge 5810 R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)，EPPENDORF公司)；KQ3200DE超聲儀器(昆山超聲儀器有限公司)。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品：茉莉酸、多效唑、反式玉米素、赤霉素A3、水楊酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)脂、胺鮮酯和脫落酸，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(純度>99%)。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取反式玉米素、吲哚乙酸、脫落酸、水楊酸適量(精度0.1 mg)，用甲醇配制成2 mg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；稱取赤霉素A3、茉莉酸、蕓苔素內(nèi)脂、胺鮮酯、多效唑適量(精度0.1 mg)，用甲醇配制成10 mg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。根據(jù)每個(gè)單標(biāo)進(jìn)樣響應(yīng)值情況，分別移取反式玉米素、吲哚乙酸、脫落酸、水楊酸、赤霉素A3、茉莉酸、蕓苔素內(nèi)脂、胺鮮酯和多效唑9種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中反式玉米素、脫落酸均為0.2 mg/mL，吲哚乙酸為0.4 mg/mL，蕓苔素內(nèi)脂、水楊酸、胺鮮酯均為1 mg/mL，多效唑?yàn)?.5 mg/mL，赤霉素A3為2 mg/mL，茉莉酸為5 mg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。甲醇、乙酸均為色譜純，購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 肥料樣品的制備

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取適量的反式玉米素、吲哚乙酸、脫落酸、水楊酸、赤霉素A3、茉莉酸、蕓苔素內(nèi)脂、胺鮮酯和多效唑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成5個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，混標(biāo)編號(hào)及配制見表1。

表1 不同混合標(biāo)準(zhǔn)品水平和濃度

固體樣品制備：準(zhǔn)確稱取10 g空白肥料，在表面噴施上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，顛倒混勻后，40 ℃烘干，待測(cè)。每個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品水平做3個(gè)樣品平行。

液體樣品制備：準(zhǔn)確加入10 mL空白樣品，加入1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，振蕩混勻后待測(cè)。每個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品水平做3個(gè)樣品平行。

1.3 樣品前處理

稱取1 g肥料樣品(精度0.1 mg)，置于10 mL離心管中，加入8 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min。冷卻至室溫，用甲醇定容至10 mL，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，以10 000 ×g離心10 min，取1 mL上清液，0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后，待測(cè)。

1.4 液相色譜條件

Venusil XBP C18色譜柱(100 mm×4.6 mm×5 μm，艾杰爾中國(guó)公司)；流動(dòng)相：A為0.1%冰HAc溶液，B為甲醇。梯度洗脫條件：0～4.0 min,70%A;4.1～12.0 min,65%A;12.1～30.0 min,60%A;30.1～40.0 min,30%A;40.1～45.0 min,60%A;45.1～60.0 min,70%A。流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：茉莉酸和多效唑最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，蕓苔素內(nèi)脂、胺鮮酯、反式玉米素、赤霉素A3、水楊酸、吲哚乙酸和脫落酸最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化考察9種目標(biāo)物紫外吸收值[20 - 22]。結(jié)果表明：220 nm和222 nm處，水楊酸和吲哚乙酸吸收值大，但接近甲醇的最大吸收波長(zhǎng)，無法滿足定量分析要求；230 nm、255 nm和268 nm波長(zhǎng)分別適用于茉莉酸和多效唑、胺鮮酯以及云苔素內(nèi)酯，但其他目標(biāo)物吸收值過小；260 nm波長(zhǎng)處反式玉米素、赤霉素A3、水楊酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、胺鮮酯、脫落酸出峰良好且基線平穩(wěn)。綜合分析，選擇用230 nm和260 nm雙波長(zhǎng)模式檢測(cè)。其中，以230 nm波長(zhǎng)檢測(cè)茉莉酸、多效唑；以260 nm波長(zhǎng)檢測(cè)反式玉米素、赤霉素A3、水楊酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、胺鮮酯和脫落酸。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的HPLC法測(cè)定一般以甲醇和水為流動(dòng)相[23]。本實(shí)驗(yàn)采用不同含量甲醇作流動(dòng)相洗脫樣品，結(jié)果表明當(dāng)甲醇含量為30%時(shí)，整體分離度最好，但反式玉米素和赤霉素A3特征峰拖尾、峰肩交叉嚴(yán)重，容易與樣品中其它雜質(zhì)重疊。加入冰HAc可以有效抑制樣品的解離，改善峰拖尾情況，將水相更換成不同梯度濃度的HAc水溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其濃度為0.1%時(shí)各特征峰實(shí)現(xiàn)完全分離[24]，結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

2.1.3 流速的選擇設(shè)置0.5、1.0、1.5 mL/min 3個(gè)流速，分別考察樣品的分離度[25]。結(jié)果表明，升高流速分離度變差，出峰時(shí)間縮短，柱壓升高；降低流速分離度提高，出峰時(shí)間延長(zhǎng)，柱壓下降。當(dāng)流速大于1.0 mL/min時(shí)，反式玉米素與赤霉素A3的色譜峰部分重疊，水楊酸與吲哚乙酸的色譜峰重疊；當(dāng)流速為0.5 mL/min時(shí)，各色譜峰分離度改善，基線平穩(wěn)，出峰時(shí)間適當(dāng)。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇0.5 mL/min的流速。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 方法回收率在空白肥料樣品中，分別添加5個(gè)濃度水平的9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述色譜方法測(cè)定，計(jì)算各個(gè)添加濃度下的回收率，結(jié)果見表2?？梢钥闯?，該方法平均回收率在91.92%～104.68%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)<5%。表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表2 肥料樣品中9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的加標(biāo)回收率(n=3)

(續(xù)表2)

2.2.2 線性方程和線性范圍分別吸取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)上述肥料處理方法處理，按上述色譜條件進(jìn)樣，以溶液質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限列于表3。

表3 線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.2.3 方法精密度利用同一空白樣品，準(zhǔn)確稱取5個(gè)平行試樣，分別添加不同濃度的9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。

表4 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

(續(xù)表4)

3 結(jié)論

本方法可同時(shí)檢測(cè)肥料中反式玉米素、赤霉素A3、水楊酸、吲哚乙酸、茉莉酸、多效唑、脫落酸、蕓苔素內(nèi)脂和胺鮮酯9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，方法檢測(cè)種類多，色譜分離效果好，基線平穩(wěn)，線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到0.998以上，平均加標(biāo)回收率在91.92%～104.68%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)<5%，準(zhǔn)確度和精密度都滿足方法學(xué)指標(biāo)，是對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的市場(chǎng)推廣和行業(yè)規(guī)范的一種可靠的檢測(cè)方法。