余婷玉， 蔡 爽， 高運(yùn)苓， 李 靜*,3

(1.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽(yáng)市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，湖北襄陽(yáng) 441021；2.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院·化學(xué)工程學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441053；3.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽(yáng)市中心醫(yī)院，白癜風(fēng)特色制劑襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北襄陽(yáng) 441021)

反相色譜(Reversed-Phase Liquid Chromatography，RPLC)的分離效率高、分析對(duì)象覆蓋范圍廣，且可與多種檢測(cè)器兼容，在日趨多樣化的色譜分離模式中仍占據(jù)主流地位。其中，疏水性長(zhǎng)鏈烷基鍵合硅膠是目前應(yīng)用最廣泛的反相色譜固定相[1,2]。硅膠基質(zhì)具有機(jī)械強(qiáng)度高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、粒徑及孔徑可控、易于表面化學(xué)修飾等諸多優(yōu)勢(shì)，但也存在一定的缺陷：(1)在進(jìn)行鍵合相修飾前，通常會(huì)采用酸或熱處理對(duì)硅膠進(jìn)行再次羥基化以增加硅羥基的數(shù)量、提高功能基的鍵合率[3]。然而，約有50%的硅羥基由于空間位阻無(wú)法參與鍵合反應(yīng)，以形成氫鍵的結(jié)合狀態(tài)或游離狀態(tài)殘留，其中游離的硅羥基呈現(xiàn)較強(qiáng)的酸性，在色譜分析中易與堿性化合物以及富含-COOH、-NH2等親水性基團(tuán)的多肽或蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)產(chǎn)生較強(qiáng)的相互作用，造成峰拖尾甚至發(fā)生不可逆吸附，大大降低分離度與靈敏度[4]；(2)長(zhǎng)鏈烷基鍵合硅膠在高比例水相的流動(dòng)相中易出現(xiàn)疏水塌陷，RPLC中最常用的C18色譜柱尤為明顯，因而對(duì)于極性物質(zhì)的分離能力十分有限[5]。

為改善上述缺陷，色譜學(xué)者們提出了極性修飾的反相色譜固定相[6]。在硅膠與疏水烷基長(zhǎng)鏈之間插入酰胺基、脲基、磺酰胺基等極性基團(tuán)，稱為極性嵌入，合成過(guò)程通常需要分兩步進(jìn)行，但由于空間位阻影響，第二步反應(yīng)產(chǎn)率有限，最終得到的固定相表面基團(tuán)不均勻，且殘余的活性極性基團(tuán)會(huì)降低烷基的疏水分離性能；以含氨基、氯、羥基等極性基團(tuán)的短鏈硅烷化試劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的三甲基氯硅烷等封端劑對(duì)硅膠基質(zhì)中的殘留硅羥基進(jìn)行封閉稱為極性封端，這種方法得到的固定相具有與普通的烷基鍵合固定相相似的反相保留特性，同時(shí)可改善長(zhǎng)鏈烷基鍵合硅膠在高比例水相中的疏水塌陷問(wèn)題，但與極性嵌入相比，極性基團(tuán)的負(fù)載量較低，因此掩蔽硅羥基的效果稍差[6 - 8]。

1993年，Wirth等提出通過(guò)“水平聚合”的方式在硅膠微球表面同時(shí)鍵合長(zhǎng)鏈C18和短鏈C3：先將干燥的硅膠置于濕潤(rùn)氮?dú)庵?，使其吸附一層水分子，而后繼續(xù)在無(wú)水環(huán)境下進(jìn)行鍵合。在單分子水層的作用下，十八烷基三氯硅烷和丙基三氯硅烷在硅膠表面水解并通過(guò)Si-O-Si產(chǎn)生水平方向聚合[9]。他們?cè)诤罄m(xù)研究中還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)水平聚合法制備的鍵合硅膠C18負(fù)載密度更高，殘余硅羥基的數(shù)量也得以減少；且Si-O-Si在硅膠表面的密集分布形成了一層膜狀的“空間屏障”，使其能夠耐受極端pH值的流動(dòng)相[10,11]。梁鑫淼課題組在水平聚合的基礎(chǔ)上提出了一種改良極性封尾方法，以含有極性基團(tuán)的短鏈烷基代替C3，得到同時(shí)具有疏水長(zhǎng)鏈烷基和極性短鏈的鍵合硅膠，稱為“極性共聚合(Polar-copolymerization)”[12]，并將該合成方法引入到多種類型固定相的合成中，實(shí)現(xiàn)了生物堿和蛋白質(zhì)的良好分離[13 - 18]。由于水平聚合能夠有效提高硅烷鍵合率，因此通過(guò)極性共聚合得到的新型固定相碳負(fù)載量更高、穩(wěn)定性更強(qiáng)、極性封尾效果更好。

在本研究中，我們通過(guò)極性共聚合法(PC法)對(duì)硅膠進(jìn)行C18和二醇基共修飾，在不同條件下制備一系列極性共聚合固定相(PCSP)，詳細(xì)考察在極性共聚合過(guò)程中，硅膠潤(rùn)濕度、極性硅烷偶聯(lián)劑投料量等反應(yīng)條件對(duì)硅羥基掩蔽效果的影響；同時(shí)與采用傳統(tǒng)鍵合法(Conventional Bonding，CB法)制備的固定相(CBSP)進(jìn)行比較，深入探討了PCSP在堿性物質(zhì)分離分析中的多重優(yōu)勢(shì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

JSM-35CF掃描電鏡(日本，JEOL)；TriStarⅡ全自動(dòng)比表面分析儀(美國(guó)，Micromeritics)；AVATAR 360傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)，Thermo)；TG 209 F1 Libra熱重分析儀(德國(guó)，NETZSCH)；LC-20A高效液相色譜儀(日本，Shimadzu)；DDS -307電導(dǎo)率儀(上海精密科學(xué)儀器)。

硅膠基質(zhì)來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室自制(合成方法參照前期工作[19]，粒度5～7.5 μm)；阿米替林、菲、秋水仙堿、2-萘胺、延胡索乙素、利多卡因，均購(gòu)于阿拉丁試劑(上海)有限公司；分析純H2SO4、HCl、甲苯購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十八烷基三氯硅烷(ODS)購(gòu)于百靈威科技有限公司；3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)購(gòu)于武漢大學(xué)有機(jī)硅新材料有限公司；色譜純甲醇和乙腈購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。實(shí)驗(yàn)用水為Heal Fore NW系統(tǒng)(上海)制備的超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活化硅膠按照1 g∶10 mL的比例將硅膠加至6 mol·L-1的HCl中，120 ℃加熱回流12 h，然后用超純水洗至中性，160 ℃真空干燥，即得到不含吸附水的干燥硅膠。

1.2.2 潤(rùn)濕硅膠參照文獻(xiàn)方法[9]，將干燥氮?dú)庖院愣ǖ牧魉偻ㄟ^(guò)裝有200 mL超純水的三頸燒瓶中，燒瓶置于恒溫水浴中加熱，三頸燒瓶出口端連接至裝有干燥硅膠的玻璃瓶，玻璃瓶出口插入濕度計(jì)，調(diào)節(jié)水浴溫度使?jié)穸染S持在50%左右，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后即得到單分子水層潤(rùn)濕的硅膠。

硅膠的潤(rùn)濕度以干燥硅膠質(zhì)量增重率(+w%)計(jì)算：+w%=(m3-m2)/(m2-m1)，其中m1為空瓶質(zhì)量，m2為加入干燥硅膠后總瓶重，m3為經(jīng)過(guò)一段時(shí)間潤(rùn)濕后的總瓶重。干燥硅膠的潤(rùn)濕度計(jì)為0%。

1.2.3 硅膠鍵合與裝柱在三頸燒瓶中加入干燥(CB法)或潤(rùn)濕(PC法)硅膠，按照1 g∶10 mL的比例加入無(wú)水甲苯，在干燥氮?dú)夥諊?，加入一定比例的ODS和GOPTS，攪拌下110 ℃加熱回流8 h；反應(yīng)完成后所得產(chǎn)物依次用甲苯和甲醇抽洗3次，80 ℃干燥后加入甲醇-稀H2SO4(0.5 mmol·L-1)的混合溶液(30∶70,V/V)中，100 ℃回流3 h，水洗至中性，80 ℃干燥，即得到CBSP或PCSP；將所得固定相用甲醇勻漿，在7 000 psi下分別填裝至不銹鋼空柱管(100 mm×2.1 mm i.d.)中。

1.2.4 酸性硅羥基的測(cè)定與評(píng)估采用電導(dǎo)滴定法測(cè)定材料中酸性硅羥基的數(shù)量[4]。稱取50 mg固定相材料，加入60%甲醇溶液10 mL使其均勻分散，再加入1 mL 0.1 mol·L-1HCl，然后用0.1 mol·L-1NaOH溶液進(jìn)行滴定，記錄體系中電導(dǎo)率K的變化，繪制電導(dǎo)滴定曲線，并根據(jù)電導(dǎo)率上升第一階段消耗的NaOH溶液體積來(lái)計(jì)算酸性硅羥基的相對(duì)含量。

根據(jù)色譜柱評(píng)價(jià)參考標(biāo)準(zhǔn)文件870[20]，以阿米替林為探針，根據(jù)其在各固定相上的保留時(shí)間和拖尾因子評(píng)估各固定相中的殘余酸性硅羥基活性。阿米替林母液用甲醇配制成1 mg·mL-1，進(jìn)樣前用流動(dòng)相稀釋至25 μg·mL-1。色譜條件：80%甲醇-20%磷酸鹽緩沖溶液(PBS，5 mmol·L-1，pH為7.0或7.6)；流速：0.15 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料合成與表征

表1列舉了采用PC或CB兩種方法，在不同條件下合成得到的一系列固定相及對(duì)應(yīng)的熱重失重率(各批次硅膠的初始投料量均為4 g)。

表1 不同條件下合成的PCSP及CBSP

圖1(a)、1(b)分別為自制硅膠微球的掃描電鏡(SEM)圖及氮吸附曲線，自制硅膠的比表面積約為163 m2·g-1，平均孔徑約為8.2 nm，累積孔容為1.15 cm3·g-1；圖1(c)為P-4制備過(guò)程中各步產(chǎn)物的傅立葉紅外光譜表征結(jié)果，當(dāng)硅膠與ODS和GOPTS發(fā)生反應(yīng)后，在921 cm-1出現(xiàn)的弱峰為環(huán)氧基C-O鍵的振動(dòng)信號(hào)，2 860 cm-1和2 930 cm-1處的雙峰為C18長(zhǎng)鏈的C-H對(duì)稱和不對(duì)稱伸縮振動(dòng)信號(hào)，在酸性環(huán)境下開環(huán)后得到P-4，環(huán)氧基轉(zhuǎn)化為二醇基，921 cm-1處的特征信號(hào)幾乎消失，C18特征信號(hào)無(wú)明顯變化，由此表明P-4材料表面鍵合基團(tuán)為C18和二醇基；將相同質(zhì)量的C-1、P-1、P-4、P-7加入至相同體積純水中，強(qiáng)烈振搖后如圖1(d)所示，C-1具有極強(qiáng)的疏水性，漂浮于液面上且大量沾壁，P-1、P-4、P-7三種材料在水中呈現(xiàn)良好分散，且P-7在水中的分散性最佳，無(wú)沾壁現(xiàn)象，說(shuō)明通過(guò)極性共聚合法摻入二醇基后可改善疏水長(zhǎng)鏈烷基鍵合硅膠在水中的浸潤(rùn)性，且材料的親水性隨GOPTS投料比例的提高而增強(qiáng)，對(duì)于極性化合物在高比例水相中的分離十分有利。

圖1 PCSP及CBSP的表征(a：自制硅膠的掃描電鏡(SEM)圖；b：自制硅膠的氮吸附曲線及孔徑分布圖；c：P-4及中間體的傅立葉紅外(FT-IR)光譜圖；d：各固定相在水中的分散性)

2.2 硅膠潤(rùn)濕度對(duì)硅烷鍵合率的影響

P-1～P-5為在硅烷投料比相同、硅膠潤(rùn)濕度依次增加的條件下得到的系列PCSP，從表1可以看出：(1)PCSP的TG%高出CBSP約6%：在PCSP中，表面吸附單層水分子為ODS和GOPTS的水解帶來(lái)更多的活性位點(diǎn)，在硅膠表面以水平方向發(fā)生聚合，形成一層Si-O-Si的“膜結(jié)構(gòu)”，有效地提高了硅烷鍵合率；(2)硅烷鍵合量與硅膠潤(rùn)濕度呈正相關(guān)：隨著+w%(0.66%～5.27%)的增加(P-1～P-4)，TG%持續(xù)增加，說(shuō)明在單分子水層吸附達(dá)到飽和前，吸附的水分子越多，越有利于極性共聚合的進(jìn)行，但當(dāng)+w%繼續(xù)提高至6.97%(P-5)，TG%不再有明顯增加，可能是聚合反應(yīng)達(dá)到最大限度，因此硅膠潤(rùn)濕度約5%為最佳聚合條件。值得注意的是，不同硅膠吸附水分子的能力不同，因而最佳潤(rùn)濕度也不一致，對(duì)于不同來(lái)源的硅膠應(yīng)單獨(dú)優(yōu)化[21]。

2.3 硅膠潤(rùn)濕度對(duì)酸性硅羥基的影響

在色譜柱評(píng)價(jià)參考標(biāo)準(zhǔn)文件870[20]中，阿米替林(pKa=9.4)的拖尾因子與其保留時(shí)間關(guān)聯(lián)不大，因而作為評(píng)估色譜柱峰形對(duì)稱性的探針?lè)治鑫?。阿米替林在以C-1、P-3、P-4為固定相的色譜柱上的保留及峰形如圖2所示。在C-1中，殘余酸性硅羥基與堿性阿米替林發(fā)生不可逆吸附，阿米替林未能被洗脫；而在P-3和P-4中，極性基團(tuán)二醇基的加入有效降低了酸性硅羥基的數(shù)量，并在一定程度上有空間屏蔽效果，因而可以削弱阿米替林與硅膠基質(zhì)之間的相互作用，有效改善其拖尾或不可逆吸附現(xiàn)象；由于硅膠的潤(rùn)濕度更高，P-4鍵合的C18和二醇基均更多，因此阿米替林的保留時(shí)間大幅度增加，接近于P-3的2倍，拖尾因子也相比P-3進(jìn)一步減小?？偟膩?lái)說(shuō)，在反應(yīng)未達(dá)到飽和的情況下，極性共聚合法對(duì)酸性硅羥基的屏蔽效果、對(duì)硅烷鍵合率的提高程度均與硅膠潤(rùn)濕度呈正相關(guān)。

圖2 阿米替林在由C-1(a)、P-3(b)和P-4(c)裝填的色譜柱上的色譜圖(圖標(biāo)為保留時(shí)間和拖尾因子)

2.4 二醇基相對(duì)含量對(duì)酸性硅羥基的影響

P-6、P-4、P-7為在相同硅膠潤(rùn)濕度、ODS:GOPTS的投料比逐漸增加的條件下合成得到的PCSP(表1)，圖3展示了阿米替林在該系列PCSP上的保留行為。鑒于當(dāng)流動(dòng)相pH=7.0時(shí)，阿米替林在C-1上發(fā)生不可逆吸附，因此將流動(dòng)相的pH值調(diào)整為7.6，以抑制阿米替林吸附在P-6(不含二醇基、C18鍵合量相對(duì)C-1更高)上的吸附。在圖3中，阿米替林的保留時(shí)間及拖尾因子均按照P-6、P-4、P-7的順序依次減小，與投料中GOPTS的比例呈負(fù)相關(guān)。這是由于反應(yīng)過(guò)程中，投入硅烷總量不變，ODS與GOPTS競(jìng)爭(zhēng)鍵合位點(diǎn)，當(dāng)GOPTS∶ODS的投料比逐漸增加時(shí)，制備的固定相中C18的鍵合量相對(duì)減少、二醇基的鍵合量相對(duì)增加，對(duì)于酸性硅羥基的屏蔽效果理論越強(qiáng)，因此阿米替林的峰形拖尾情況改善效果越好，保留時(shí)間也逐漸縮短。

圖3 阿米替林在由P-6(a)、P-4(b)和P-7(c)填裝的色譜柱上的色譜圖(圖標(biāo)依次為保留時(shí)間和拖尾因子)

通過(guò)電導(dǎo)滴定法測(cè)定P-6、P-4和P-7中酸性硅羥基的數(shù)量來(lái)驗(yàn)證上述結(jié)果，P-6、P-4和P-7在溶液電導(dǎo)率上升第一階段消耗的NaOH溶液體積分別為330、200和160 μL，由此計(jì)算出各材料中酸性硅羥基的含量依次為6.6 μmol·g-1、4.0 μmol·g-1和3.2 μmol·g-1，與圖3中阿米替林的出峰情況完全一致；P-6由于未加入GOPTS，酸性硅羥基數(shù)量最多，加入一定比例GOPTS后，固定相中的酸性硅羥基被二醇基短鏈所覆蓋，P-4和P-7的含量依次降低至60%、48%，由此可證明二醇基對(duì)酸性硅羥基的掩蔽作用，且掩蔽效果與其相對(duì)鍵合量呈正相關(guān)。

2.5 堿性樣品在PCSP與CBSP上的分離

4種代表性的小分子堿性化合物在P-4和C-1上的峰形如圖4所示。秋水仙堿、2-萘胺、延胡索乙素、利多卡因依次被洗脫，在C-1上的拖尾因子分別為：1.491、1.250、2.487、2.143，在P-4上的拖尾因子分別為：1.168、0.993、1.224、1.462，均優(yōu)于各自在C-1上的表現(xiàn)。由此可以看出，將PCSP應(yīng)用于堿性樣品分離時(shí)，可有效屏蔽酸性硅羥基，抑制堿性分析物的拖尾。

圖4 堿性樣品在C-1和P-4為固定相的色譜柱上的色譜圖

3 結(jié) 論

本文通過(guò)極性共聚合法，成功制備了一系列由疏水性C18和極性二醇基共同修飾的硅膠固定相，并詳細(xì)考察了硅膠潤(rùn)濕度、極性基團(tuán)加入比例等反應(yīng)條件對(duì)硅羥基掩蔽效果的影響。相比于傳統(tǒng)方法，極性共聚合法可有效提高硅烷鍵合率，改善烷基鍵合硅膠的親水性，有效屏蔽酸性硅羥基、改善堿性物質(zhì)的拖尾；此外，極性共聚合固定相對(duì)酸性硅羥基的屏蔽效果與硅膠潤(rùn)濕度、二醇基的相對(duì)鍵合比例均呈正相關(guān)；代表性小分子堿性藥物的良好分離及對(duì)稱峰形顯示出PCSP在堿性物質(zhì)色譜分析中的應(yīng)用價(jià)值。