張羽森,張瑱,韓兆峰

(1 鄭州人民醫(yī)院整形美容外科,河南 鄭州 450000；2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形美容外科)

皮膚損傷后成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞增殖加速和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量合成是瘢痕疙瘩的病理學(xué)基礎(chǔ)，但目前其發(fā)病原因及機(jī)制尚未完全明確[1]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)是DNA甲基化過程中的一個(gè)重要分子。而DNA甲基化酶催化基因甲基化后可抑制基因轉(zhuǎn)錄及復(fù)制，導(dǎo)致基因相關(guān)的平衡失調(diào)，最終導(dǎo)致疾病發(fā)生[2]。DNMT1與纖維化及增生存在密切關(guān)系，尤其是細(xì)胞增殖和癌細(xì)胞存活[3]。但DNMT1與瘢痕疙瘩相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。已有研究顯示，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KFB)中DNMT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的KFB凋亡，并抑制成纖維細(xì)胞因子DNMT1和TGF-β1表達(dá)，上調(diào)Smad7表達(dá)[4]。提示抑制基因甲基化有可能成為瘢痕疙瘩防治的新方法。因此，本文探討沉默DNMT1表達(dá)對(duì)KFB增殖及侵襲能力影響，為該病治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1標(biāo)本來源 瘢痕疙瘩標(biāo)本取自2016年5月—2017年10月鄭州人民醫(yī)院整形美容外科手術(shù)切除病灶，共9例，取自前胸部3例，耳垂部5例，上臂1例。選擇標(biāo)準(zhǔn)：病人無瘢痕疙瘩感染破潰及治療史，無免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等用藥史，無全身系統(tǒng)性疾病。樣本采集均符合手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，病人均簽訂知情同意書，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce；CCK8溶液購(gòu)自上海碧云天公司；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板及Matrigel膠均購(gòu)自美國(guó)BD；DNMT1、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、c-myc、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體均購(gòu)自美國(guó)CST；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIORAD。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1KFB的培養(yǎng) 無菌條件下切取瘢痕疙瘩病人的病變組織。瘢痕疙瘩組織均經(jīng)病理檢查而明確診斷。采用組織貼壁法原代培養(yǎng)KFB，即將組織剪成2 cm×2 cm大小，浸泡在含青霉素-鏈霉素的生理鹽水無菌盒中，用手術(shù)刀將組織塊削成厚度為1 mm左右的薄片，再剪成3 mm×3 mm大小組織塊。用槍鑷按照0.5～1.0 cm間距將組織平鋪在50 mL的無菌培養(yǎng)瓶中，向瓶中加入約0.5 mL的RPMI 1640培養(yǎng)液，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，底部朝上，放入含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、90%濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后加入含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，以使培養(yǎng)液能恰好覆蓋組織塊，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每2 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察KFB長(zhǎng)滿瓶底后，胰蛋白酶消化、培養(yǎng)液終止消化，接種至新的培養(yǎng)瓶。經(jīng)3～4次傳代，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法[5]根據(jù)Gen Bank中提供的人DNMT1基因序列以及siRNA原則，設(shè)計(jì)針對(duì)DNMT1的特異性siRNA序列，同時(shí)提供隨機(jī)序列作為陰性對(duì)照siRNA，序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組(陰性組)和DNMT1-siRNA組(實(shí)驗(yàn)組)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代KFB接種于6孔板，培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)達(dá)30%～50%匯合度時(shí)，陰性組和實(shí)驗(yàn)組將依據(jù)脂質(zhì)體制備的siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入至6孔板，空白組加脂質(zhì)體，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，換成細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，應(yīng)用Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞DNMT1的蛋白表達(dá)。

1.2.3轉(zhuǎn)染效果和Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)[6]以適量細(xì)胞裂解液提取轉(zhuǎn)染siRNA后的細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。DNMT1稀釋比為1∶500，內(nèi)參照GAPDH稀釋比為1∶1 000，加HRP標(biāo)記的二抗稀釋比為1∶3 000，37 ℃孵育1 h。TBST洗膜，加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在暗室室溫下溫育5 min，X線膠片曝光、顯影、定影。同法檢測(cè)β-catenin、c-myc、MMP-2和PCNA蛋白的表達(dá)。

1.2.4細(xì)胞增殖能力檢測(cè)[7]以3×107/L細(xì)胞密度接種生長(zhǎng)狀態(tài)良好的4代KFB于96孔板，每孔100 μL，孵育24 h后按照上述分組轉(zhuǎn)染siRNA，同時(shí)設(shè)置空白組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染的24、48、72和96 h取出96孔板，加CCK8試劑(每孔10 μL)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)[8]將40 μL的 Matrigel(用預(yù)冷無血清培養(yǎng)基以1∶3比例稀釋)加入到預(yù)冷的Transwell小室中，37 ℃孵育2 h以使膠凝固。上室中加入轉(zhuǎn)染siRNA 48 h的細(xì)胞，下室中加入600 μL的完全培養(yǎng)基，用結(jié)晶紫染色10 min，倒置顯微鏡(400倍)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 DNMT1在轉(zhuǎn)染DNMT1-siRNA的KFB表達(dá)

DNMT1-siRNA轉(zhuǎn)染KFB后 48 h，Western blotting檢測(cè)DNMT1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，空白組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量分別為0.679±0.059、0.679±0.059和0.087±0.012，實(shí)驗(yàn)組DNMT1表達(dá)明顯低于空白組(F=139.156，P<0.05)，而陰性組DNMT1表達(dá)與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 DNMT1在轉(zhuǎn)染DNMT1-siRNA的KFB表達(dá)

2.2 沉默DNMT1表達(dá)對(duì)KFB活力的影響

CCK8方法檢測(cè)沉默DNMT1對(duì)KFB活力影響的結(jié)果見表1。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，不同時(shí)間、組間及其二者交互作用下KFB活力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=1 197.182，F(xiàn)時(shí)間=1 380.040，F(xiàn)交互=19.115，P均<0.001)。實(shí)驗(yàn)組的KFB活力在24～96 h均顯著低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組內(nèi)=45.688～57.141，F(xiàn)組間=15.037～28.811，P均<0.05)。

表1 沉默DNMT1表達(dá)不同轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)KFB活力的影響

2.3 沉默DNMT1表達(dá)對(duì)KFB侵襲能力的影響

Transwell小室檢測(cè)沉默DNMT1后KFB侵襲能力的結(jié)果顯示，空白組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為176.7±9.2、172.8±8.5和91.2±4.6，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲能力顯著低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=117.810，P<0.05)。

2.4 沉默DNMT1表達(dá)對(duì)KFB 的Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響

Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin和c-myc及下游PCNA和MMP-2的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與空白組比較，實(shí)驗(yàn)組β-catenin、c-myc、PCNA和MMP-2的蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.926～103.743，P<0.05)。見圖2和表2。

表2 各組β-catenin、c-myc、PCNA和MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 沉默DNMT1表達(dá)對(duì)KFB 的Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響

3 討 論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要分支，其在調(diào)節(jié)機(jī)體生命活動(dòng)過程中作用顯著，機(jī)體內(nèi)DNA異常甲基化，可伴隨DNMTs異常表達(dá)[9]。DNMT1是從真核生物中第一個(gè)克隆出來的DNMTs，主要功能是維持DNA復(fù)制后的甲基化狀態(tài)[10]。已有多項(xiàng)研究表明，DNMT1在腫瘤發(fā)生、胚胎發(fā)育、細(xì)胞衰老等過程中起重要作用[11-13]。瘢痕疙瘩是傷口愈合及修復(fù)過程中以KFB過度增殖及ECM大量沉積為特點(diǎn)的體表纖維化疾病。已有研究結(jié)果表明，DNMT1表達(dá)水平與瘢痕疙瘩生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)越靠近邊緣區(qū)域的瘢痕疙瘩組織的DNMT1表達(dá)越高[14]。這提示DNMT1與瘢痕疙瘩的進(jìn)行性生長(zhǎng)及浸潤(rùn)生長(zhǎng)存在密切關(guān)系。而DNMT1表達(dá)上調(diào)提示KFB存在異常甲基化。

RNA干擾(RNAi)是一種在mRNA水平上高度特異性沉默基因的機(jī)制，由于合成的小干擾RNA(siRNA)體積小、包封率高及安全性高，已成為重要的核酸類藥物，用于多種疾病的治療[15]。已有多項(xiàng)研究表明，抑制基因表達(dá)可降低KFB生長(zhǎng)，如轉(zhuǎn)染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低該基因在KFB內(nèi)的表達(dá)，從而抑制了瘢痕疙瘩生長(zhǎng)[16]；siRNA沉默DNMT1基因可抑制KFB生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示，沉默DNMT1可抑制KFB活力和侵襲能力。

Wnt/β-catenin信號(hào)在細(xì)胞增殖、分化、侵襲遷移、凋亡及腫瘤形成等多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。近年來越來越多的研究也表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與多種纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制存在密切關(guān)系[18-19]。如Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵分子β-catenin在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)明顯升高，TGF-β刺激可上調(diào)成纖維細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)[20]。以上結(jié)果提示，在包括瘢痕疙瘩在內(nèi)的纖維化疾病中Wnt/β-catenin信號(hào)發(fā)揮重要作用，且可能是潛在的治療靶點(diǎn)。而也有研究指出，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)可以降低KFB增殖，如Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1可抑制成纖維細(xì)胞增殖、遷移及膠原生成等[21]。PCNA與細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞增殖密切相關(guān)。已有研究結(jié)果表明，PCNA表達(dá)水平可有效反映瘢痕組織增生程度[22]。MMP-2是MMPs家族成員，其主要負(fù)責(zé)基底膜上的Ⅳ型膠原降解。有研究表明，瘢痕疙瘩的侵襲遷移機(jī)制與MMP-2存在密切關(guān)系，抑制MMP-2的表達(dá)可降低KFB侵襲能力[23-24]。本研究結(jié)果顯示，沉默DNMT1表達(dá)可下調(diào)β-catenin、c-myc、PCNA和MMP-2表達(dá)，提示沉默DNMT1表達(dá)可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路而降低KFB增殖和侵襲能力。

綜上所述，本研究顯示沉默DNMT1表達(dá)可抑制KFB增殖和侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。提示DNMT1有可能是瘢痕疙瘩治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。但DNMT1上游調(diào)控基因有哪些，是如何調(diào)控DNMT1基因表達(dá)而參與瘢痕疙瘩發(fā)生及發(fā)展過程均尚需進(jìn)一步探究，這可為進(jìn)一步揭示瘢痕疙瘩發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。