劉洪娟 徐亞偉

(上海市第十人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海200072)

基因療法具有治療1萬多種人類單基因疾病的潛力，并能使更多的復(fù)雜多基因疾病受益。CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng)，存在于大多數(shù)細(xì)菌和古生菌中。原核生物在遭到病毒入侵后，能夠把病毒DNA的一小段提取出來并存儲到自身基因組上的特定區(qū)域，把這個(gè)區(qū)域稱為CRISPR存儲空間。當(dāng)再次遇到病毒入侵時(shí)，原核生物能夠根據(jù)存儲的DNA片段識別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效。根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)的特性，科學(xué)家將其改造成了目前最高效的基因組編輯工具[1]。其中，CRISPR/Cas9是一種古老的細(xì)菌免疫防御系統(tǒng)，于2002年首次在原核生物中鑒定，被重新應(yīng)用到基因編輯技術(shù)中，為研究人員提供了一種革命性的基因療法工具[2]，2012年，Jennifer和Emmanuelle證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在體外切割雙鏈DNA[1]；2013年，張鋒首次用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在原核生物 (大腸桿菌) 中實(shí)現(xiàn)基因組編輯[3]，目前尚無相關(guān)臨床水平的應(yīng)用[4-5]。天然的CRISPR/Cas9系統(tǒng)由三部分組成：SpCas9(以下簡稱Cas9)、crRNA和tracrRNA。其中，crRNA和tracrRNA通過局部堿基配對組成guide RNA(gRNA)，gRNA與Cas9蛋白結(jié)合后引導(dǎo)Cas9蛋白識別和切割目標(biāo)DNA序列(圖1)。Cas9蛋白要成功識別目標(biāo)序列必須滿足兩個(gè)條件：(1)sgRNA的5’端20 nt和靶DNA之間堿基配對；(2)靶DNA的3’端有合適的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)序列。CRISPR/Cas9切割目標(biāo)DNA后產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)[6]。CRISPR/Cas9最基礎(chǔ)的技術(shù)就是基因敲除，即在基因的上下游各設(shè)計(jì)一條gRNA(gRNA1和gRNA2)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，向?qū)NA通過堿基互補(bǔ)配對可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除[非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)][7]。另外，在此NHEJ修復(fù)基礎(chǔ)上為細(xì)胞引入修復(fù)模板質(zhì)粒(供體DNA分子)，會引入片段插入或定點(diǎn)突變，實(shí)現(xiàn)基因的替換或者突變[進(jìn)行同源介導(dǎo)的雙鏈DNA修復(fù)(HDR)]，例如對受精卵細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，并將其導(dǎo)入代孕母體中，可以實(shí)現(xiàn)基因編輯動(dòng)物模型的構(gòu)建[8]。目前，CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于基因激活，疾病模型構(gòu)建，甚至是基因治療等相關(guān)領(lǐng)域，以往基因編輯同細(xì)胞精確編輯的效率通常很低[9]，而CRISPR/Cas9提供可靶向特定精確位點(diǎn)[10]，并且能同時(shí)干擾靶向多個(gè)基因[11](詳見圖1)，為研究復(fù)雜的多基因疾病提供了新的可能性，特別適用于體外和體內(nèi)的不同研究，并已用于評估基因功能、疾病建模、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和測試新型治療方法等多項(xiàng)研究[12]。目前CRISPR/Cas9在腫瘤和遺傳疾病治療中應(yīng)用較廣泛，如肺小細(xì)胞癌、胃癌、大腸癌及罕見疾病治療等[13-15]。正在進(jìn)行的大多數(shù)腫瘤臨床治療試驗(yàn)都采用CRISPR/Cas9來創(chuàng)建用于癌癥免疫療法的嵌合抗原受體T細(xì)胞基因編輯(CAR-T)[16-17]。CRISPR系統(tǒng)還用于非基因編輯目的，例如激活和抑制基因表達(dá)，以及用于熒光定位標(biāo)記染色體區(qū)域和單個(gè)mRNA[18]。另外，CRISPR/Cas9基因編輯已成功構(gòu)建多種模式動(dòng)物，如轉(zhuǎn)基因綿羊和基因敲除豬等[19-20]。在過去的十年中，基因組編輯技術(shù)的發(fā)展從根本上改變了生物醫(yī)學(xué)研究，在腫瘤科研和臨床領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但在心血管領(lǐng)域的相關(guān)研究值得總結(jié)和探討。

心血管疾病是中國老年人發(fā)病和死亡的主要原因之一，被認(rèn)為是主要的公共衛(wèi)生問題。目前基因組編輯工具已被用于探究諸如心肌病、心律不齊等心血管相關(guān)疾病的作用機(jī)制[12]。且已有研究表明在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)Cas9并不會影響心臟功能或相關(guān)基因表達(dá)，Cas9特異性敲入小鼠已被用于編輯心臟Myh6、Sav1和Tbx2061等基因，但目前心血管領(lǐng)域的治療性基因組編輯研究有限[21]。以下將更具體地描述二者相關(guān)研究進(jìn)展。

1 心臟發(fā)育

在心血管系統(tǒng)開始運(yùn)轉(zhuǎn)之前，胚胎主要通過彌散的方式獲取營養(yǎng)和氧氣，然而，隨著胚胎發(fā)育需要，心臟發(fā)育將在后續(xù)發(fā)揮重要作用[22]。研究表明CRISPR/Cas9通過干預(yù)心臟再生中的小孔蛋白，心臟發(fā)育中的心臟祖細(xì)胞遷移和Wnt/β-Catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建斑馬魚心臟發(fā)育模型[22]。除了構(gòu)建動(dòng)物模型，CRISPR/Cas9還可以通過進(jìn)行種系基因組編輯參與心臟發(fā)育，開發(fā)為遺傳性心臟病的治療工具，如使用CRISPR/Cas9在人類生殖細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對引起肥厚型心肌病的MYBPC3突變的校正[23]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成gtpbp3基因敲除斑馬魚，發(fā)現(xiàn)gtpbp3敲除斑馬魚線粒體tRNA代謝異常，異常的線粒體tRNA代謝損害線粒體翻譯，產(chǎn)生蛋白酶抑制應(yīng)激，改變呼吸鏈復(fù)合物的活性，導(dǎo)致胚胎心臟發(fā)育的改變，并減少突變斑馬魚心室的短縮，而敲除gtpbp3基因的斑馬魚心室心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維紊亂[24]，提示CRISPR/Cas9通過干預(yù)相關(guān)基因編輯參與心臟發(fā)育。

2 動(dòng)脈粥樣硬化/心力衰竭

CRISPR/Cas9基因編輯調(diào)控心血管相關(guān)疾病進(jìn)展是目前研究熱點(diǎn)。如：通過CRISPR/Cas9敲除ApoE/ApoC3基因可構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型[25-26]；體內(nèi)AAV-CRISPR/Cas9介導(dǎo)的低密度脂蛋白受體(LDLR)基因剪輯可部分挽救LDLR表達(dá)并有效改善LDLR突變體誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化表型[27-28]。用慢病毒載體轉(zhuǎn)染Cas9，并引導(dǎo)RNA在譜系陰性的骨髓細(xì)胞中引入Tet2和Dnmt3a失活突變，將細(xì)胞植入到化療小鼠體內(nèi)，持續(xù)注射血管緊張素Ⅱ，Tet2或Dnmt3a失活突變的小鼠表現(xiàn)出更明顯的心肌肥厚，心功能減弱，以及更嚴(yán)重的心臟和腎臟纖維化[29]。通過CRISPR/Cas9靶向Mef2d表達(dá)的gRNA載體可以有效構(gòu)建心肌肥大表型[30]。將CRISPR/Cas9與短模板寡核苷酸結(jié)合，在斑馬魚的同源基因中產(chǎn)生四種攜帶不同的導(dǎo)致人類心血管疾病ATP敏感鉀通道與Cantu綜合征相關(guān)(Kir6.1、KCNJ8、SUR2和ABCC9)的基因突變，導(dǎo)致心室明顯增大，心輸出量和收縮功能增強(qiáng)，腦血管明顯擴(kuò)張[31]。以上說明基因編輯在誘導(dǎo)心血管疾病中具有重要作用，同時(shí)其在治療心血管疾病基礎(chǔ)研究中也發(fā)揮同等作用，如： CRISPR/Cas9介導(dǎo)FKBP5基因缺失，通過正反饋回路增強(qiáng)FKBP5對核因子κB的反應(yīng)，具有治療急性心肌梗死的作用[32]。CRISPR/Cas9敲入表達(dá)雙重趨化因子GCP-2和SDF-1α的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能是缺血性血管疾病的替代治療選擇[33]。即CRISPR/Cas9為心血管相關(guān)疾病研究提供新的方法論。

3 心血管臨床前基因治療研究

目前在臨床水平通過基因組編輯可以治療或預(yù)防兩種類型的心血管疾病，第一類是心血管伴有遺傳的疾病，如肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、先天性長QT綜合征和引起心臟功能障礙的肌肉營養(yǎng)不良，第二類是馬凡綜合征和家族性肺動(dòng)脈高壓等疾病[19，21]。另外，隨著人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的發(fā)展，CRISPR/Cas9敲除和敲入特定基因的干細(xì)胞可顯著增加治療心血管疾病的可能性[34]。如采用CRISPR/Cas9技術(shù)將TALEN基因敲入人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞中，以糾正PLN基因中與擴(kuò)張型心肌病相關(guān)的基因突變，并在體內(nèi)(通過腺相關(guān)病毒)向小鼠施用該系統(tǒng)，被證明可改善壓力超負(fù)荷期間或誘發(fā)心肌梗死后的心臟功能[21，27]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因在調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，PCSK9基因的功能獲得性突變可導(dǎo)致高膽固醇血癥和相關(guān)的動(dòng)脈硬化，CRISPR/Cas9敲除PCSK9基因?qū)⒃黾映赡晷∈蟮腖DLR表達(dá)并實(shí)現(xiàn)臨床治療作用[22]，提示CRISPR/Cas9在心血管疾病基礎(chǔ)研究治療中均發(fā)揮有效作用，但目前尚無心血管領(lǐng)域的直接臨床應(yīng)用。

綜上，CRISPR/Cas9代表了基因組編輯技術(shù)的突破性進(jìn)展，為在體外和體內(nèi)操縱基因組開辟了新途徑，盡管到目前為止，小型動(dòng)物模型研究已經(jīng)穩(wěn)定，但仍存在部分基因脫靶效應(yīng)，會延長基礎(chǔ)研究及臨床治療時(shí)間，目前尚無法在人類心臟中進(jìn)行基因校正，在心血管中的應(yīng)用主要集中在遺傳性心臟病臨床前動(dòng)物模型中的直接治療干預(yù)和基礎(chǔ)研究[35]，因此可結(jié)合相關(guān)課題相關(guān)研究，發(fā)掘新的疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)后，采用基因編輯技術(shù)干預(yù)相關(guān)基因，實(shí)現(xiàn)基因治療心血管疾病的可能方案。