王浩東，張嘉宇，錢燦燦，魏姿涵，吳彩蘭，楊德松

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000)

敵草隆(Diuron)，化學(xué)名稱為3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲，是一種低毒、高效的取代脲類除草劑，廣泛應(yīng)用于棉花、甘蔗[1]、葡萄[2]等作物的苗前除草。該藥還在新疆作為棉花脫葉劑(復(fù)配制劑噻苯·敵草隆)廣泛應(yīng)用于棉田機(jī)械化作業(yè)中[3]。然而，敵草隆對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥類有輕微毒性，對(duì)水生無(wú)脊椎動(dòng)物中等毒性，在土壤和地下水中具有持久性[4]。在施藥后70 d，徑流水和土壤中仍可以檢測(cè)到低濃度的敵草隆[5]。因此，研究敵草隆的降解對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的影響受到人們?nèi)找骊P(guān)注，Khongthon 等[6]在微米反應(yīng)器中通過(guò)電化學(xué)高級(jí)氧化工藝降解敵草隆，降解率約為90%；Vanraes 等[7]優(yōu)化了介質(zhì)阻擋放電(Dieletric barrier discharge, DBD)等離子體反應(yīng)器與活性炭紡織材料吸附相結(jié)合的裝置，可以最大限度地減少敵草隆在水中的氧化副產(chǎn)物的生成。在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展進(jìn)程中，微生物降解農(nóng)藥作為一種生態(tài)友好型技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景[8]，生物修復(fù)環(huán)境中殘留的敵草隆是目前最佳途徑之一。據(jù)報(bào)道，目前分離得到的降解敵草隆的菌株主要為白腐真菌 (Phanerochaete chrysosporium[9]、Ganoderma lucidum[10]、Trametes versicolor[11]、)，費(fèi)氏埃希菌Escherichia fergusonii[12]及嗜根寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas rhizophila[13]。本文從長(zhǎng)期施用敵草隆的棉田土壤中篩選分離出降解效果好的敵草隆降解菌株，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，探索菌株的降解特性及優(yōu)化降解條件，提高菌株降解效率，以期為該菌劑的制備提供理論基礎(chǔ)，對(duì)敵草隆污染土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 儀器 超凈工作臺(tái)；高速冷凍離心機(jī)；生化培養(yǎng)箱；高壓滅菌鍋；PCR儀；紫外分光光度計(jì)；高效液相色譜儀 (Waters e2695 Separations Module)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；恒溫水浴鍋；搖床；超純水器；精確電子分析天平；烘箱；震蕩儀。

1.1.2 土壤采集及制備 2018 年 9 月在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師147團(tuán)和149團(tuán)采集連續(xù)施用敵草隆藥劑10年以上的棉田，取土深度10～20 cm，各采集1 kg。將采集的土樣去除大粒石塊并過(guò)2 mm篩，風(fēng)干后貼標(biāo)存于密封袋，置于4 ℃冰箱保存。

1.1.3 藥劑及培養(yǎng)基 藥劑：敵草隆原藥、敵草隆標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%)購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；甲醇(分析純)、二氯甲烷(分析純)購(gòu)于天津市富余精細(xì)化工有限公司；無(wú)水硫酸鈉(分析純)購(gòu)于天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司。

液體培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 ( MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.5 g，(NH4)2SO41 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2)，富集培養(yǎng)基 (在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加所需含量的敵草隆)，LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL)；固體培養(yǎng)基均在以上液體培養(yǎng)基中加入18 g/L瓊脂粉末，高氏一號(hào)培養(yǎng)基(可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 敵草隆降解菌株的篩選 在含 100 mg/L 敵草隆的90 mL富集培養(yǎng)液中加入10 g供試土樣，在 30 ℃、180 r/min 下培養(yǎng) 7 d 后，取體積分?jǐn)?shù)為10%的混合液體，接種到含500 mg/L敵草隆的富集培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，再按照10%(φ)的接菌量將上述富集培養(yǎng)液接種到含1 000 mg/L敵草隆的富集培養(yǎng)液中，如此持續(xù)不斷轉(zhuǎn)接至 1 500、1 800、2 000 mg/L時(shí)，進(jìn)行平板涂布，觀察菌落形成情況(2 000 mg/L 時(shí)未形成菌落)。

隨機(jī)從1 800 mg/L富集培養(yǎng)液的平板中挑取36組形態(tài)不同且清晰的菌落通過(guò)劃線處理的方法接種于含100 mg/L敵草隆的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待平板長(zhǎng)出單個(gè)菌落，直至培養(yǎng)基中敵草隆質(zhì)量濃度為2 000 mg/L(進(jìn)行壓力篩選)，取7株生長(zhǎng)良好的菌株編號(hào)并放入4 ℃的冰箱內(nèi)進(jìn)行保存。

從以上7株菌落中挑取單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 下制成菌液。在含 100 mg/L敵草隆的無(wú)機(jī)鹽降解培養(yǎng)基中加入10%體積的菌液，置于搖床上，分別搖培 3、6、9、12、15 d 后，HPLC法檢測(cè)降解液中敵草隆的含量，計(jì)算降解率(重復(fù)3次，設(shè)置無(wú)菌對(duì)照)。

1.2.2 敵草隆的 HPLC 檢測(cè) 取降解液 2 mL 于管內(nèi)，12 000 r/min 離心處理 8 min，取上層液體 1 mL 與二氯甲烷4 mL，充分震蕩后分層，取下層有機(jī)相至無(wú)水硫酸鈉柱中，將過(guò)柱后的液體移至圓底燒瓶，減壓濃縮至接近干燥，加入甲醇定容至2 mL，再通過(guò)有機(jī)相微孔過(guò)濾器過(guò)濾后裝入樣瓶，待液相色譜檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱 5.0 μm×4.6 mm×250 mm、流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=60∶40、流速 1.0 mL/min、柱溫35 ℃、測(cè)定波長(zhǎng) 254 nm、進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.3 敵草隆降解菌株的鑒定 將降解率最高的菌株接種至LB平板上，30 ℃條件下培養(yǎng)，進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)(生理生化鑒定參照BIOLOG GEN III、API 20 E、API 20 NE 等說(shuō)明書，其中BIOLOG GEN III鑒定板用于革蘭陰性和陽(yáng)性好氧菌的鑒定，API 20E是腸桿菌科和其他G-桿菌的標(biāo)準(zhǔn)鑒定系統(tǒng)，API 20NE是鑒定不屬腸桿菌科、革蘭陰性非苛養(yǎng)桿菌的標(biāo)準(zhǔn)鑒定系統(tǒng))。

選擇新鮮菌體作為PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行分子鑒定，采用細(xì)菌16S rRNA序列通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492-R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增菌株目標(biāo)片段。PCR 反應(yīng)體系 (100 μL)：正、反向引物 (10 μmol/L)各 2 μL；Taq(5 U/μL)0.8 μL；10×PCR Buffer(Mg2＋Plus)10 μL；dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)8 μL；模板 DNA 2.5 ng；ddH2O 補(bǔ)足到 100 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，57 ℃1 min，72 ℃ 1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

使用引物 nrdA-F (5′-ACTGATTCCCGA CCTGTTC-3′)和 nrdA-R(5′-TTCGATTTGAC GTACAAGTTCTGG-3′)擴(kuò)增菌株目標(biāo)片段。nrdAPCR 反應(yīng)體系 (100 μL)：正、反向引物 (50 μmol/L)各 2 μL；Taq(2.5 U/μL)0.8 μL；10×PCR Buffer(Mg2＋Plus)10 μL；dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)8 μL；模板 DNA 10 ng；ddH2O 補(bǔ)足到 100 μL。nrdAPCR 反應(yīng)條件： 95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，將結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)，采用臨位連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株降解率的影響 探索降解菌在不同敵草隆初始質(zhì)量濃度、接菌量、蔗糖含量、pH、溫度及最優(yōu)條件下對(duì)敵草隆的降解效果，評(píng)估降解能力，其中敵草隆初始質(zhì)量濃度為25、50、100、200和 500 mg/ L；接菌量為 1%、3%、5%、10%和 15%(φ)；蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.0%、0.5%、1.0%、1.5% 和 2.0%；pH 為 5.0、6.0、7.0、8.0和 9.0；溫度為 20、25、30、35 和 40 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS 22.0與Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，運(yùn)用Duncan’s法進(jìn)行各處理間的多重比較分析，本試驗(yàn)所顯示的結(jié)果均為3次重復(fù)測(cè)定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測(cè)敵草隆的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用敵草隆標(biāo)準(zhǔn)品分別配置 20、50、100、200、500、1 000 mg/L 的敵草隆樣品，進(jìn)行 HPLC 檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，添加水平為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=4.13×104x+1.81×105(R2=0.99)(圖1)，相對(duì)保留時(shí)間為 5.658 min(圖2)。

圖1 敵草隆的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig. 1 The standard curve of diuron

圖2 敵草隆的標(biāo)樣色譜圖Fig. 2 The standard HPLC-UV chromatogram of diuron

2.2 HPLC檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和精密度

敵草隆在空白培養(yǎng)基中的添加質(zhì)量濃度分別為 25、50、100 mg/L，進(jìn)行 HPLC 檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)5次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。測(cè)定的樣品中敵草隆的回收率為94.72%～96.99%，RSD為1.29%～1.86%(表1)，符合對(duì)敵草隆的殘留檢測(cè)要求，可用于培養(yǎng)基中敵草隆殘留檢測(cè)。

表1 敵草隆在培養(yǎng)基中的回收率Table 1 The recovery rate of diuron in medium

2.3 敵草隆降解菌的降解速率測(cè)定

經(jīng)平板初篩，逐步提高培養(yǎng)基中敵草隆的含量進(jìn)行壓力篩選，篩選出7株菌株并對(duì)其命名為SL-6、SL-7、SL-8、SL-9、SL-10、SL-11 和 SL-12，涂板保存。初篩獲得的7株菌株，在含100 mg/L敵草隆、接菌量 10%(φ)的培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

菌株SL-6、7、9對(duì)敵草隆的降解效果明顯高于其余4株。且在第15天，降解率均高達(dá)90%以上(圖3)，因此選取該3株菌株開展后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 初篩菌株對(duì)敵草隆的降解率Fig. 3 Degradation rate of diuron by preliminary screening strains

在敵草隆質(zhì)量濃度為100 mg/L的培養(yǎng)基中，以10%的接菌量(φ)分別接種初篩獲得3個(gè)菌株后，敵草隆的消解動(dòng)態(tài)符合消解動(dòng)力學(xué)方程。如表2所示，菌株SL-6、7、9對(duì)培養(yǎng)基中的敵草隆消解方程分別為ρt= 74.482e-0.213t、ρt= 59.264e-0.166t、ρt= 58.165e-0.182t，其中ρt為t時(shí)刻敵草隆的質(zhì)量濃度；半衰期分別為 3.2、4.2、3.8 d。

表2 敵草隆的消解動(dòng)力學(xué)方程和相關(guān)參數(shù)Table 2 Digestion kinetic equation and related parameters of diuron

2.4 降解菌株的鑒定

分別提取3株敵草隆降解菌株的DNA，并將其作為模板，利用16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別得到 1 500 bp 左右的片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收連接轉(zhuǎn)化，然后進(jìn)行測(cè)序。將菌株 SL-6、7、9的 16S rDNA基因序列在 GeneBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株SL-6、7、9與變形菌門Proteobacteria的Achromobacter xylosoxidans菌株的16S rDNA序列相似度均高達(dá)99.94%以上，由此首先確定菌株SL-6、7、9均為無(wú)色桿菌屬Achromobacter，因此選取該3株菌種降解率最高(94.6%)的SL-6進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)及進(jìn)一步鑒定，并將菌株SL-6鑒定至種。

2.5 菌株SL-6的鑒定

2.5.1 菌株 SL-6 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株 SL-6 的 LB 培養(yǎng)基菌落形態(tài)為白色，其單菌落形態(tài)呈白色且表面隆起，外表光滑濕潤(rùn)，邊緣光滑平整不透明，有黏性；菌株SL-6的革蘭氏染色呈陰性(圖4)。

圖4 菌株SL-6的常規(guī)形態(tài)學(xué)特征Fig. 4 Conventional morphological characteristics of strain SL-6

2.5.2 菌株 SL-6 的生理生化特征 菌株 SL-6 細(xì)胞形態(tài)呈桿狀；經(jīng)BIOLOG GEN III鑒定反應(yīng)呈陽(yáng)性的包括氧化酶、接觸酶、對(duì)羥基苯乙酸、糊精、丙酮酸甲酯、檸檬酸、1%乳酸鈉、林可霉素、萘啶酸、夫西地酸、十四烷硫酸鈉、亞碲酸鉀、葡糖醛酰胺、丙酸、乙酸、糖質(zhì)酸、醋竹桃霉素、萬(wàn)古霉素、氨曲南、利福霉素、二甲胺四環(huán)素、四唑紫、四唑藍(lán)、丁酸鈉、α-D-葡萄糖、D-果糖、L-丙氨酸、L-乳酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、α-酮戊二酸、D-蘋果酸、L-鼠李糖、L-焦谷氨酸、L-蘋果酸、L-絲氨酸、D-半乳糖醛酸、γ-氨基丁酸、α-羥丁酸、D-葡糖酸、β-羥基-D,L-丁酸、D-葡萄糖醛酸、α-丁酮酸、D-果糖-6-磷酸，反應(yīng)呈弱陽(yáng)性的包括溴代丁二酸、鹽酸胍、氯化鋰、黏酸、甲酸、溴酸鈉、D-巖藻糖、L-組氨酸、D-天冬氨酸，反應(yīng)呈陰性的包括明膠、龍膽二糖、蔗糖、松二糖、水蘇糖、肌苷、果膠、吐溫-40、肌醇、甘油、乙酰乙酸、奎寧酸、D-甘露糖、甘氨酸-L-脯氨酸、D-麥芽糖、D-乳酸甲酯、D-海藻糖、D-半乳糖、L-精氨酸、D-纖維二糖、3-甲基-D-葡萄糖、L-巖藻糖、D-絲氨酸、D-棉子糖、D-山梨醇、α-D-乳糖、D-甘露醇、D-蜜二糖、D-阿糖醇、L-半乳糖酸內(nèi)酯、D-水楊苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸；API 20E鑒定反應(yīng)呈陽(yáng)性的包括精氨酸雙水解酶、檸檬酸、丙酮酸鹽，反應(yīng)呈陰性的包括賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、硫代硫酸鈉、脲酶、色氨酸脫氨酶、色氨酸、明膠；API 20NE鑒定反應(yīng)呈陽(yáng)性的包括硝酸鉀，反應(yīng)呈陰性的包括色氨酸、葡萄糖、精氨酸、脲素、七葉靈、明膠、β-半乳糖苷酶。以上生理生化特征所包含的資料庫(kù)無(wú)法將其鑒定至種，故后續(xù)通過(guò)16S rDNA與nrdA基因序列進(jìn)行分析鑒定。

2.5.3 菌株 SL-6 與相關(guān)菌種的 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 采用臨位連接法顯示菌株SL-6與相關(guān)菌種的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計(jì)算，菌株SL-6與木糖氧化無(wú)色桿菌A. xylosoxidans的相似性最高，為100%。(圖5)。

圖5 基于16S rDNA序列的菌株SL-6與相關(guān)菌種的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 5 Phylogenetic tree of strain SL-6 and related strain species based on 16S rDNA sequence

2.5.4 菌株 SL-6 與相關(guān)菌種的nrdA基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 采用臨位連接法顯示菌株SL-6與相關(guān)菌種的nrdA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計(jì)算，圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值。菌株SL-6與木糖氧化無(wú)色桿菌A. xylosoxidans的nrdA基因序列相似性高達(dá) 99.996%(圖6)。

圖6 基于nrdA基因序列的菌株SL-6與相關(guān)菌種的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of strain SL -6 and related strain species based on nrdA gene sequence

2.6 SL-6菌株不同培養(yǎng)條件對(duì)敵草隆降解率的影響

2.6.1 敵草隆質(zhì)量濃度對(duì)敵草隆降解率的影響降解率隨著敵草隆初始質(zhì)量濃度的增加呈逐漸增加后減少的趨勢(shì)(圖7A)。當(dāng)培養(yǎng)液中敵草隆質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，降解效果最佳，第3天的降解率高達(dá)82.2%；當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，第3天的降解率為39.4%，僅為200 mg/L質(zhì)量濃度的47.9%。

圖7 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株SL-6降解敵草隆的影響Fig. 7 Effect of various cultural conditions on diuron degradation by strain SL-6

2.6.2 菌株不同接菌量對(duì)敵草隆降解率的影響隨著接菌量增大，敵草隆的降解率也隨之增高，當(dāng)接菌量(φ)為15%時(shí)，降解率為63.5%，但接菌量在5%～15%之間，降解率的提高并不顯著(圖7B)。

2.6.3 外加碳源含量對(duì)敵草隆降解率的影響 向培養(yǎng)液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的蔗糖作為外加碳源(圖7C)，3 d后敵草隆的降解率并未有較大變化。與不添加碳源相比，添加0.5%～2.0%的蔗糖碳源，降解率在40.6%～53.2%之間，均低于不添加碳源的57.4%降解率。

2.6.4 培養(yǎng)液pH對(duì)敵草隆降解率的影響 分析培養(yǎng)液pH對(duì)菌株SL-6降解率影響，結(jié)果表明，pH 8時(shí)降解率最高，為59.6%(圖7D)。

2.6.5 培養(yǎng)溫度對(duì)敵草隆降解率的影響 分析不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株SL-6降解率的影響，結(jié)果表明，20～40 ℃時(shí)的降解率呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢(shì)，溫度為30℃時(shí)，降解效果最佳，第3天的降解率高達(dá)57.2%；當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，第3天的降解率為18.2%，僅為 30℃ 的 31.8%(圖 7E)。

2.6.6 最優(yōu)培養(yǎng)條件下菌株降解率 最優(yōu)敵草隆初始質(zhì)量濃度為 200 mg/L、接菌量為 15%(φ)、pH為8、培養(yǎng)溫度為30℃，該條件下，分別于1、2、3、4、5 d后，運(yùn)用液相色譜法檢測(cè)培養(yǎng)液中敵草隆的剩余濃度，并計(jì)算降解率。菌株SL-6在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，隨著時(shí)間的增加，敵草隆的降解率亦隨之增高，第5天的降解率為93.1%；第1天的降解率為43.1%，僅為第5天的46.3%(圖7F)。

3 討論與結(jié)論

在連續(xù)施用敵草隆10年以上的棉田中分離得到降解菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)試、16S rDNA及nrdA基因序列相似性分析，鑒定菌株SL-6為木糖氧化無(wú)色桿菌A. xylosoxidans。本研究結(jié)果表明：菌株SL-6在敵草隆初始質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，降解率為82.2%；接菌量為15%(φ)時(shí)，降解率為63.5%；pH為8時(shí)，降解率為59.6%；溫度為30 ℃時(shí)，降解率為57.2%；與不添加蔗糖相比，添加蔗糖后降解率均低于57.4%。于上述最優(yōu)培養(yǎng)條件下，在第5天，菌株SL-6對(duì)200 mg/L的敵草隆降解率達(dá)93.1%。

本研究分離得到1株高效降解敵草隆的菌株，為木糖氧化無(wú)色桿菌，是一種毒力較弱的革蘭陰性桿菌。該菌能夠引起輕微的菌血癥、心包炎、導(dǎo)管相關(guān)的血流感染、肺炎等[14]，相較而言，該菌株治理環(huán)境污染時(shí)表現(xiàn)出極大潛力，在合理規(guī)范的操作下，引起人體不適微乎其微，有研究表明，該菌株可通過(guò)碳酸鹽礦化作用固定土壤中的復(fù)合重金屬(Cu、Pb、Cd)[15]以及固結(jié)土壤中的有效態(tài)Cd，從而減少水稻對(duì)Cd的吸收[16]。

國(guó)內(nèi)外已有可降解敵草隆的部分真菌和細(xì)菌，以及對(duì)降解條件進(jìn)行優(yōu)化的報(bào)道。孫紀(jì)全等[17]報(bào)道了1株細(xì)菌菌株Y57，鑒定為鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonassp.,該菌株在敵草隆初始質(zhì)量濃度為20 mg/L，30℃ 及 5%(φ)接菌量時(shí)，其降解率達(dá)到80%以上，與該研究相比，本研究所得降解條件中敵草隆初始質(zhì)量濃度更高，接菌量更大，培養(yǎng)溫度相同，但降解率相對(duì)較高。封國(guó)君等[18]報(bào)道了1株真菌菌株D12，鑒定為鐮刀菌屬Fusarium，該菌株在敵草隆初始質(zhì)量濃度為50 mg/L，35 ℃及pH 6.0時(shí)，經(jīng)過(guò)7 d培養(yǎng)，降解率為57.42%，半衰期為7.30 d，與該研究相比，本研究所得降解條件為堿性環(huán)境，培養(yǎng)溫度更低，敵草隆初始質(zhì)量濃度更高，同時(shí)降解率相對(duì)更高。楊孟然[19]報(bào)道了敵草隆降解菌株D47(Arthrobacter globiformis)，處理 4 d 后該菌株對(duì)0.5～20.0 mg/L的敵草隆降解率均為100.0%，與該研究相比，本研究所得降解條件中敵草隆初始質(zhì)量濃度更高，但處理時(shí)間與降解率相對(duì)較低。以上學(xué)者報(bào)道的降解菌株在降解過(guò)程中敵草隆初始質(zhì)量濃度較低，而本研究中菌株SL-6可在敵草隆初始質(zhì)量濃度較高的環(huán)境中對(duì)其進(jìn)行降解，無(wú)需外加碳源，適于敵草隆殘留極端的環(huán)境條件，同時(shí)菌株SL-6降解敵草隆的最適溫度在30 ℃，該溫度下無(wú)需供給額外能量，此外，菌株SL-6只有一定的耐弱堿性，而新疆棉田土壤呈一定的弱堿性，為該菌株的生產(chǎn)應(yīng)用提供條件。菌株SL-6的降解能力與pH及溫度等因素密切相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)在接菌量較低的情況下，其對(duì)敵草隆的降解能力大大減弱。經(jīng)過(guò)系列分析推測(cè)，該菌株降解敵草隆時(shí)，產(chǎn)生的酶的活性不是特別高，后期應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化。

迄今為止，對(duì)于敵草隆降解菌的研究大部分集中于降解特性，關(guān)于降解機(jī)制的相關(guān)研究較少。敵草隆的主要代謝產(chǎn)物為3,4-二氯苯胺(DCA)、3-(3,4-二氯苯基)脲 (DCPU )、3-(3,4-二氯苯基)-1-甲基脲 (DCPMU )[20]。變色栓菌[21]Trametes versicolor培養(yǎng)7 d后，除降解敵草隆(降解率為83%)外，主要代謝產(chǎn)物DCA(降解率為100%)迅速降解，在降解過(guò)程中，根據(jù)鑒定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，3-(3,4-二氯苯基)-1-羥甲基-1-甲基脲(DCPHMU)代謝為N′端去烷基化合物DCPMU和DCPU，DCPHMU的發(fā)現(xiàn)揭示了羥基化對(duì)N′端去甲基化的相關(guān)作用，有助于更好地研究敵草隆降解機(jī)制的反應(yīng)機(jī)理。