珍稀植物華木蓮SRK基因的克隆與亞細胞定位

邱珊姍，鄧凌帆，劉苗苗，張建強，王顏波，劉齊元，王建革*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江西 南昌 330045；2.南昌工程學(xué)院 水利與生態(tài)工程學(xué)院，江西 南昌 330029；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】植物雜交育種重要的目的之一是充分利用雜種優(yōu)勢。作為促進異交防止近交的繁育機制，自交不親和（self-incompatibility，SI）是開花植物中廣泛存在的現(xiàn)象，但對于專性自交不親和植物來講，雖然后代均為雜交種，但由于親本雜合，很難獲得最大雜種優(yōu)勢。自交不親和與自交親和相互轉(zhuǎn)換在自交不親和植物中非常普遍[1-4]，如果專性自交不親和植物能夠從自交不親和轉(zhuǎn)變成自交親和，則可以通過自交育種途徑獲取最大雜種優(yōu)勢，從而為自交不親和物種育種開辟新的途徑，因此，研究自交不親和機理對于專性自交不親和植物育種方式轉(zhuǎn)變具有重要意義。珍稀木蘭科（Magnoliaceae）植物華木蓮（Sinomanglietia glauca）為遲發(fā)性自交不親和（late-acting SI，LSI）物種，研究發(fā)現(xiàn)其存在孢子體自交不親和（sporophytic SI，SSI）決定基因S 位點受體激酶（S_locus receptor kinase，SRK）基因高度同源的基因。研究該基因在華木蓮自交不親和中的作用，不僅為揭示華木蓮自交不親和機理研究提供理論資料，對華木蓮育種方式改變也具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】基于表型遺傳控制模式，通常將植物自交不親和分為配子體自交不親和（gametophytic SI，GSI）及孢子體自交不親和（SSI）兩類，后來，又分出了遲發(fā)性自交不親和（LSI）類型[5-6]。研究表明，自交不親和由一個S位點控制，其上包含2個緊密連鎖的S基因：花粉S決定基因和雌蕊S 決定基因，它們以單倍型形式出現(xiàn)，連鎖被打破則會造成自交不親和向自交親和的轉(zhuǎn)換[2]。在具有配子體自交不親和特性的車前科（Plantaginaceae）、茄科（Solanaceae）和薔薇科（Rosaceae）植物中，雌蕊S 決定因子為柱頭S 核糖核酸酶（S-ribonuclease，S-RNase），花粉S 決定因子為花粉S 位點Fbox（S-locus F-box，SLF）或S 單倍型特有F-box（S-haplotype-specific F-box，SFB）。罌粟科（Papaveraceae）植物中自交不親和雖然也為配子體自交不親和，但雌蕊決定因子為柱頭乳頭細胞分泌蛋白（stigmaexpressed secreted protein，PrsS），花粉決定因子為花粉表達跨膜受體蛋白（pollen-expressed transmembrane protein，PrpS）[7]。十字花科（Brassicaceae）植物中自交不親和為孢子體自交不親和類型，雌蕊決定因子為柱頭S位點受體激酶（SRK），花粉決定因子為花粉外殼S位點富半胱氨酸蛋白（S-locus cysteine-rich protein，SCR）或S 位點蛋白11（S-locus protein 11，SP11）[8]。相對于上述兩種自交不親和，遲發(fā)性自交不親和研究相對滯后，遺傳機制并不清楚。研究表明，遲發(fā)性自交不親和通常分布于同科或同屬物種中[6]，在木蘭科（Magnoliaceae），除華木蓮（S.glauca）外，白玉蘭（Magnolia denudata）自花授粉后花粉管生長與異花花粉管生長相同，但胚珠發(fā)育停滯在魚雷期，也表現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和[9]。遲發(fā)性自交不親和在被子植物基部類群中發(fā)現(xiàn)較多，這些物種在系統(tǒng)發(fā)生上聚集成簇，但詳細研究僅限于基部類群中的五味子科（Schisandraceae），不過木蘭分支自交不親和物種中尚未發(fā)現(xiàn)配子體自交不親和與孢子體自交不親和類型[6]。值得關(guān)注的是，雖然遲發(fā)性自交不親和分子機制并不清楚，但在具有遲發(fā)性自交不親的特性的山茶科茶樹（Camellia sinensis）中發(fā)現(xiàn)了與孢子體自交不親和雌性決定基因SRK基因高度同源基因[10-11]。SRK同源基因是目前遲發(fā)性自交不親和中發(fā)現(xiàn)的唯一一類與已知自交不親和基因高度同源的基因，這引發(fā)了以下問題：1）SRK基因是否在遲發(fā)性自交不親和反應(yīng)中起作用？2）如果起作用，其功能是什么？在什么部位、在何時起作用？3）如果SRK基因在遲發(fā)性自交不親和中無作用，如此保守的SRK基因的功能是什么？華木蓮（S.glauca），又名落葉木蓮（Manglietia decidua），是木蘭科珍稀植物，形似木蓮，落葉特性上又與木蘭相似，進化上處于木蓮屬和木蘭屬連接位置，在被子植物起源和演化方面具有重要科研價值[12-13]。華木蓮花果、干形均具觀賞價值，在園林應(yīng)用上也極具應(yīng)用前景。目前華木蓮分布在江西宜春明月山和湖南永順個別地區(qū)，分布區(qū)呈狹島狀，面積不足36 km2，被列入國家保護和拯救物種[13-14]。華木蓮生存競爭力弱，種群天然更新能力差，扦插、組培均未成功，目前只能靠種子繁殖。細胞學(xué)和胚胎學(xué)研究表明，華木蓮大小孢子正常、胚胎發(fā)育也正常[15-16]。傳粉生物學(xué)表明，華木蓮雖然數(shù)量不多，且具自交不親和特性，但野生70 年生植株仍有單株產(chǎn)果約45 kg、產(chǎn)籽45 000 粒的能力,人工繁育表明，經(jīng)過低溫沙藏的種子萌發(fā)率在90%以上[17]。以上結(jié)果表明生殖保障并非是華木蓮瀕危的原因，瀕危原因在于生存競爭力弱。華木蓮為專性自交不親和植物，如果能改變?nèi)A木蓮繁育方式，通過人工培育，充分利用雜種優(yōu)勢，提高華木蓮生存競爭力，則將為華木蓮育種帶來新局面。華木蓮自花和異花花粉管生長6 h并無差別，未授粉心皮在7 d 左右脫落，自花授粉心皮在15 d 左右脫落，表現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和特征，轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出了SRK高度同源基因SgSRK。為了揭示SgSRK基因在華木蓮遲發(fā)性自交不親和中的作用，本研究對該基因進行了克隆和亞細胞定位研究，研究結(jié)果表明SgSRK基因具有典型的SRK結(jié)構(gòu)域和理化性質(zhì)，擁有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，具備磷酸化功能，亞細胞定位觀察支持該基因編碼蛋白定位在細胞膜和細胞質(zhì)中。

【本研究切入點】鑒于到目前為止，SRK同源基因是目前遲發(fā)性自交不親和中發(fā)現(xiàn)的唯一一類與已知自交不親和基因高度同源的基因，因此，研究華木蓮SRK同源基因在遲發(fā)性自交不親和中的作用成為揭示華木蓮自交不親和機制的著手點。【擬解決的關(guān)鍵問題】SgSRK克隆及亞細胞定位觀察可為研究該基因在華木蓮自交不親和中的功能及如何發(fā)揮功能的提供依據(jù)，進而為揭示華木蓮自交不親和機理提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

華木蓮栽植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園中。花期取授粉后3 h 自花授粉心皮用液氮固定，后置于-80 ℃貯存，用于總RNA提取。瞬時表達供試材料為煙草品種K326，將種子用蒸餾水沖洗后，置于培養(yǎng)皿中室溫催芽1～2 d，后置于人工氣候箱培養(yǎng)，條件為光/暗時間為16 h/8 h，光/暗溫度為24 ℃/18 ℃，濕度為85%條件下培養(yǎng)，60 d后至5～6片真葉展露后用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達。

1.2 華木蓮SgSRK 基因克隆

TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 和PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 購自TAKARA公司，pGME-T Easy 載體購自PROMEGA 公司，大腸桿菌DH5α購自擎科生物公司。RNA提取和反轉(zhuǎn)錄參照試劑盒程序進行。以凍存心皮為材料提取總RNA，然后用Oligo dT和隨機6-mer引物為反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計引物，SgSRK基因全長擴增引物為：Forward primer：5′-ATGGCTTTTCACATTTCATTCC-3′，Reverse primer：5′-CTATCGAGCTTCCAGCTCA-3′。反應(yīng)體系為25 μL，包括2×T5 Super PCR Mix for PAGE 12.5 μL，正向引物1 μL，反引物各1μL，模板1 μL，Nuclease-Free Water 9.5 μL。擴增程序：98 ℃3 min 變性，然后98 ℃30 s，59.8 ℃30 s，72 ℃50 s，共40 個循環(huán)，最后72 ℃2 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，目的產(chǎn)物用低熔點瓊脂糖凝膠回收。將回收產(chǎn)物連接到pGME-T Easy 載體上，然后通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，用PCR 擴增挑取陽性克隆，送擎科公司測序。

1.3 序列生信分析

為了明確克隆基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，測序后序列編碼蛋白氨基酸組成用BioXM 2.6 進行了推測；利用Pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）對編碼蛋白結(jié)構(gòu)域進行了分析，hmmer（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）驗證，用ExPASy（https://web.expasy.org/protscale/）對編碼蛋白疏水性進行了預(yù)測，用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對編碼蛋白跨膜區(qū)進行了推斷，用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對編碼蛋白信號肽進行了確認(rèn)。最后用Cell-PLoc 對編碼蛋白的亞細胞定位進行了預(yù)測。

1.4 進化分析

為了探討SgSRK基因與已知物種SRK基因間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，基于SRK 同源蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索已報道的不同物種SRK蛋白序列，去除不完整序列，同一物種蛋白取最長序列。所得到的序列然后用hmmer（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）加以鑒定，最后使用IQ-TREE 軟件基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1 000 次，進化樹用Evolview（https://www.evolgenius.info/evolview）展示。

1.5 表達載體構(gòu)建

表達載體pCAMBIA1302和NcoI酶、KpnI酶和SpeI酶購自擎科生物公司，程序參照試劑盒說明進行。對含有目的基因片段的DH5α 用LB 液體培養(yǎng)基（Tryptone 10g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L）培養(yǎng)6 h后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。對含目的片段pGME-T Easy 克隆載體用NcoI 酶切，回收目的片段，同時對表達載體pCAMBIA1302 也用NcoI 酶切，在表達載體多克隆位點NcoI-SpeI 處切開，然后將目的基因片段與之相連。將重組表達載體轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞擴增，然后提取質(zhì)粒對構(gòu)建好的重組載體用KpnI/SpeI酶切驗證連接正確性。

1.6 SgSRK基因亞細胞定位

感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101購自上海唯地生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化參照唯地公司程序進行。提取含有目的基因片段的表達載體質(zhì)粒后，通過熱激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101 中，于28 ℃下振蕩培養(yǎng)2～3 h，然后于含卡那霉素和潮霉素抗性的LB 固體培養(yǎng)基上28 ℃下進行培養(yǎng)2～3 d，對生長出的克隆用PCR 進一步驗證。挑選出的陽性克隆用含卡那霉素和潮霉素抗性的LB 液體培養(yǎng)基上28 ℃下振蕩培養(yǎng)，菌液OD600=1.0時，通過注射法侵染煙草葉片，黑暗條件下放置12 h后置于正常條件下生長36 h，用Olympus熒光顯微鏡檢測，共檢測6個葉片，每個葉片3個視野。

2 結(jié)果與分析

2.1 SgSRK基因克隆及序列分析

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組結(jié)果設(shè)計引物，利用RACE 方法，克隆到的基因片段共計2 463 bp，命名為SgSRK（GenBank登錄號：MW139903），編碼蛋白820個氨基酸，分子量92.218 ku，等電點7.15（圖1）。

2.2 SgSRK結(jié)構(gòu)分析

SgSRK 結(jié)構(gòu)分析如圖2 所示。Pfam 分析表明，SgSRK 含有4 個結(jié)構(gòu)域：B_lectin（PF01453）、S_locus_glycop（PF00954）、PAN-2（PF08276）、Pkinase Tyr（PF07714）（圖2a）。B_lectin結(jié)構(gòu)域位于73～174 aa處，主要功能可能為結(jié)合單糖，結(jié)合D-甘露糖凝集素。S_locus_glycop結(jié)構(gòu)域，即S 位點糖蛋白結(jié)構(gòu)域，位于206～315 aa處。十字花科植物中，S位點糖蛋白及S位點受體激酶與多個S等位基因相互連鎖在一起，構(gòu)成S位點。PAN-2結(jié)構(gòu)域位于336～402 aa處，包含3個二硫鍵的保守核心，是觸發(fā)蛋白互作的關(guān)鍵。Pkinase Tyr結(jié)構(gòu)域位于505～774 aa 處，催化特異酪氨酸磷酸化反應(yīng)。酪氨酸激酶是一種能將磷酸基團從ATP 轉(zhuǎn)移到細胞蛋白的酶，導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，在許多細胞功能中，充當(dāng)開關(guān)功能。ExPASy ProtScale 分析表明，編碼蛋白存在疏水區(qū)（圖2b），TMHMM 分析支持上述結(jié)果，蛋白跨膜區(qū)域位于430～452 aa 處（圖2c）。SignalP-5.0 分析表明，編碼蛋白存在一個信號肽，切點在23～24 aa 處（圖2d）。Cell-PLoc 2.0進行亞細胞定位分析表明，其定位于細胞膜與細胞質(zhì)中。

圖2 SgSRK結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structure analysis of SgSRK

上述分析表明，SgSRK 具有胞外域，跨膜域、激酶域，存在信號肽，具有磷酸化功能，是一個跨膜蛋白，與孢子體自交不親和雌性決定因子SRK結(jié)構(gòu)特征一致。

2.3 系統(tǒng)進化分析

在NCBI 上搜索已報道存在自交不親和物種SRK 蛋白，加上SgSRK，最終得到18 個序列。經(jīng)過hmmer鑒定，所有序列不僅存在4個共同結(jié)構(gòu)域：B_lectin、S_locus_glycop、PAN_2、Pkinase Tyr，而且順序也一致。利用這18 個物種SRK 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最佳模型為JTTDCMut+F+I+G4，構(gòu)建的發(fā)育樹如圖3 所示。根據(jù)系統(tǒng)樹，基部類群、木蘭分支、單子葉植物、真雙子葉植物類群各自然分開?；款惾簾o油樟（Amborella trichopoda）在最外側(cè)，其次是木蘭類華木蓮，接著是單子葉植物菠蘿（Ananas comosus）。在真雙子葉植物中，所有十字花科SRK聚為一支，同屬物種聚在一起。木蘭分支的華木蓮SgSRK與基部類群無油樟SRK距離較近，處于單子葉和真雙子葉植物外，距離真雙子葉超薔薇類頂端的十字花科SRK較遠。雖然是基因樹，但SRK基因樹大致與物種進化地位相應(yīng)。

圖3 SRK系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of SRK

2.4 華木蓮SgSRK基因的表達載體構(gòu)建

構(gòu)建的表達重組載體如圖4a 所示。表達載體pCAMBIA1302 具有35S 強啟動子和GFP 熒光蛋白基因，并攜帶卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因。從克隆載體回收的SgSRK基因，連接在表達載體的NcoI-SpeI 多克隆位點。重組載體構(gòu)建后，插入位點處酶切識別位點變化，不能從插入點通過酶切回收SgSRK基因，但可通過PCR 擴增獲得。對構(gòu)建好的載體用KpnI/SpeI 進行酶切。圖譜中質(zhì)粒有開環(huán)和閉環(huán)兩種形式，呈現(xiàn)兩條帶（圖4b）。用于侵染的農(nóng)桿菌菌株搖菌后進行PCR 驗證（圖4c），以保證含有目的基因片段。檢測結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，載體構(gòu)建成功。

圖4 a：含SgSRK的重組表達載體；b：重組表達載體酶切驗證；c：重組表達載體PCR驗證Fig.4 a：Recombinant expression vector containing SgSRK；b：Validation of recombinant expression vector by restriction enzyme digestion；c：Validation of recombinant expression vector by PCR

2.5 SgSRK基因的瞬時表達和亞細胞定位

為了驗證GFP 蛋白和目的基因在煙草中表達情況，使用熒光顯微鏡觀察了含目的基因的農(nóng)桿菌浸染的煙草葉片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖5所示。對煙草葉片直接注射含目的基因的農(nóng)桿菌，36 h后葉肉細胞質(zhì)和細胞膜處呈現(xiàn)較強熒光，表明外源基因可以在煙草中正常表達，SgSRK基因得到成功表達。對基因表達情況進行進一步觀察，可以發(fā)現(xiàn)綠色熒光在細胞質(zhì)和細胞膜上均有分布，但細胞膜上信號明顯較強，表明SgSRK定位于細胞質(zhì)中和細胞膜上，但細胞膜上更多，與生信分析結(jié)果相符。

圖5 SgSRK的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of SgSRK

3 討論與結(jié)論

借助轉(zhuǎn)錄組生信分析，本研究從華木蓮中克隆出了SgSRK基因，其編碼820 個氨基酸。編碼蛋白具有B_lectin、S_locus_glycop、PAN-2、Pkinase Tyr等4 個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，存在一個信號肽，有跨膜結(jié)構(gòu)域，為跨膜蛋白，具備磷酸化功能。共聚焦熒光顯微鏡觀察證實該基因蛋白產(chǎn)物定位在細胞質(zhì)中和細胞膜上，因此SgSRK具有典型SRK特征。

SRK基因在遲發(fā)性自交不親和中的作用是一個值得探討的問題。從自交不親和特征來看，孢子體不親和與遲發(fā)性自交不親和是兩類截然不同的類型，孢子體不親和反應(yīng)表現(xiàn)為自花花粉不萌發(fā)或萌發(fā)但不能進入柱頭，遲發(fā)性自交不親和則是自花花管粉可以穿過珠孔或完成受精，但仍然表現(xiàn)自交不親和[5-6]，這說明這兩類自交不親和的遺傳機制有所不同。到目前為止，許多植物具有孢子體自交不親和特性，但在分子水平深入研究局限于十字花科中，SRK基因為孢子體自交不親和的雌性決定基因[6]。SRK定于于柱頭乳突細胞表面，為柱頭乳突細胞分泌的一種多態(tài)性Ser/Thr 受體激酶。當(dāng)自花花粉與柱頭接觸時，花粉中的SP11/SCR 與SRK 發(fā)生反應(yīng)，使SRK 構(gòu)象發(fā)生變化，磷酸化下游因子[2,8]，啟動自交不親和反應(yīng)。因此，自花花粉并不能萌發(fā)形成花粉管或形成花粉管不能進入花柱[2]。相對于配子體自交不親和和孢子體不親和，遲發(fā)性自交不親和研究較為落后，遺傳機制尚不清楚。一個有趣的現(xiàn)象是在許多表現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和的植物中發(fā)現(xiàn)了SRK基因。表現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和特征茶樹轉(zhuǎn)錄組研究中也發(fā)現(xiàn)存在SRK基因[10-11]，同樣，在華木蓮中也發(fā)現(xiàn)了SRK同源基因SgSRK。這自然就會引發(fā)一個問題，這些SRK同源基因在遲發(fā)性自交不親和中會起作用嗎？

現(xiàn)在有一點非常明確，這些基因也與SRK在孢子體自交不親和中的作用不同，因為至少它并未阻止花粉萌發(fā)，因此，這些SRK同源基因很可能在遲發(fā)性自交不親和不起作用或作用不同。在孢子體不親和植物中，一個S位點包含2個相互連鎖的雌性決定基因SRK和花粉決定基因SCR，如果連鎖被打破，則會發(fā)生自交不親和向自交親和的轉(zhuǎn)換。目前遲發(fā)性自交和植物中尚未發(fā)現(xiàn)與孢子體自交不親和花粉決定因子SCR同源的基因，這也許可以作為SRK同源基因在遲發(fā)性自交不親和反應(yīng)中不參與或作用不同的一種解釋。如果這些基因在遲發(fā)性自交不親和中起作用，它的功能是什么？在何時起作用？如果起作用的話，它們在遲發(fā)性自交不親和中可能不是決定基因，應(yīng)該還有其它基因參與自交不親和反應(yīng)。

即使SRK同源基因不參與遲發(fā)性自交不親和反應(yīng)，它們的作用也值得探討，因為這些SRK同源基因是目前在遲發(fā)性自交不親和研究中唯一一類與已知自交不親和基因高度同源的基因，也可能成為研究遲發(fā)性自交不親和的切入點。不同物種SRK 比較表明，這些基因具有保守的結(jié)構(gòu)域。這些物種涉及被子植物基部類群的無油樟，也有單子葉植物菠蘿，也有多種真雙子葉植物，這些植物在進化上親緣關(guān)系較遠，SRK同源基因的保守性說明它們受到了強烈的自然選擇作用。雖然同源基因功能不一定相同，但從另一方面說明這些基因的功能應(yīng)該比較重要，所以才受到選擇作用。

基因過表達是驗證基因功能的主要手段之一，克隆目的基因和構(gòu)建表達載體是必須的前提。通過基因瞬時表達技術(shù)觀察基因表達產(chǎn)物的亞細胞定位可以給基因的初步作用提供指引。實驗結(jié)果表明，SgSRK 具有典型SRK 結(jié)構(gòu)域，它具有信號肽，跨膜區(qū)，是一個可以接受胞外信號的跨膜蛋白。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明，它定于于細胞質(zhì)和細胞膜上。實驗結(jié)果支持SgSRK與SRK相似，但最終華木蓮SgSRK基因在自交不親和中的作用需要進一步通過轉(zhuǎn)基因證實。

SgSRK基因具有SRK基因典型特征。

致謝：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院王義華教授，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院邊建民教授，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院羅時文教授，南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳麗敏博士，中國林科院林研所張冰玉研究員對研究給予了幫助，謹(jǐn)致謝意！