張恒 劉穎 徐旻 吳海嘯 楊慶 胡洋

不孕不育是嚴(yán)重危害人類生殖健康的世界性問題。目前全球約有10%～15%的育齡夫妻受其困擾，而其中一半是由于男性因素引起的[1]。男性不育主要是外界環(huán)境因素和遺傳因素相互作用，進(jìn)而影響精子發(fā)生過程導(dǎo)致的，臨床表現(xiàn)為男性生精障礙，如少精癥、無精癥等。遺傳因素是男性不育的主要原因之一，約占30%[2]。Y染色體微缺失和染色體核型異常是目前已知的兩個(gè)重要遺傳學(xué)病因[3]。內(nèi)分泌因素也是男性不育的主要原因之一，在精子發(fā)生和雄激素合成過程中，下丘腦-垂體-睪丸內(nèi)分泌軸發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。因此，本文對(duì)362例男性不育患者Y染色體微缺失、染色體核型及性激素水平進(jìn)行檢測(cè)與分析，探討其對(duì)男性患者不育診斷與治療的價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年1月至2021年1月因不育至金華市中心醫(yī)院就診的男性患者362例，排除梗阻性無精癥患者。依據(jù)WHO第5版《人類精液檢測(cè)與處理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估精子質(zhì)量：無精癥112例，嚴(yán)重少精癥151例，精液質(zhì)量正常99例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法 采集患者外周血標(biāo)本3份，分別行Y染色體微缺失檢測(cè)、細(xì)胞遺傳學(xué)分析和性激素水平檢測(cè)。

1.2.1 Y染色體微缺失檢測(cè) 采用qRT-PCR法。使用DNA提取試劑盒提取200 μl抗凝血的基因組DNA，用NanoDrop 2000微型紫外分光光度儀（美國Thermo Scientific）測(cè)定所提取DNA的濃度。使用7500 qRT-PCR儀（美國ABI），根據(jù)歐洲男科協(xié)會(huì)/歐洲分子遺傳質(zhì)量協(xié)作網(wǎng)發(fā)表的序列位置標(biāo)簽對(duì)Y染色體無精子因子（azoospermia factor，AZF）a、AZFb、AZFc等3個(gè)區(qū)域缺失狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系：PCR混合物 22.75 μl，酶 0.25 μl，DNA 模板 2 μl（樣品 DNA 濃度控制在10～100 g/L）。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃15 s，63 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共 10 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，63℃ 32 s，72℃ 20 s，共30個(gè)循環(huán)。發(fā)展至第三階段時(shí)，確定溫度達(dá)到63℃后采集熒光信號(hào)。

1.2.2 染色體核型異常檢測(cè) 采用細(xì)胞遺傳學(xué)分析。取患者靜脈血2 ml，加入濃度為500 U/ml的肝素抗凝，將經(jīng)旋混轉(zhuǎn)勻后用7號(hào)針頭垂直滴25滴于盛有5 ml RPMI1640的培養(yǎng)瓶中，37℃封閉培養(yǎng)72 h，在終止培養(yǎng)前3～4 h加入秋水仙堿（20 mg/L）。將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液離心，對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行低滲、固定、胰蛋白酶消化及吉姆薩染色處理，G顯帶。每例患者計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，尋找5個(gè)染色分散良好、帶紋清晰的分裂相作核型分析，核型異常者加倍計(jì)數(shù)與分析。結(jié)合人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制確定異常核型的名稱，并深入剖析異常核型。

1.2.3 性激素水平檢測(cè) 采用貝克曼DXI 800全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)及配套的血清試劑盒檢測(cè)促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、睪酮（testosterone，T）和催乳素（prolactin，PRL）水平。男性性激素水平正常范圍：FSH 為 1.27～19.26 U/L，LH 為 1.24～8.62 U/L，T 為6.07～27.10 nmol/L，PRL為 55.97～278.36 mU/L。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者Y染色體微缺失情況 362例患者中，Y染色體微缺失有28例（7.7%），包括AZFb位點(diǎn)缺失2例（0.6%）、AZFc位點(diǎn)缺失 21例（5.8%）、AZFbc位點(diǎn)缺失3例（0.8%）、AZFabc位點(diǎn)缺失2例（0.6%）。無精癥組、嚴(yán)重少精癥組、精子正常組Y染色體微缺失率分別為 11.6%（13/112）、9.9%（15/151）、0.0%（0/99），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3組患者Y染色體各位點(diǎn)缺失情況見表1。

表1 3組患者Y染色體各位點(diǎn)缺失情況（例）

2.2 3組患者染色體核型異常情況 無精癥組發(fā)現(xiàn)染色體核型異常18例，異常率為16.1%（18/112），包括染色體數(shù)目異常11例、染色體結(jié)構(gòu)異常4例、性反轉(zhuǎn)3例；嚴(yán)重少精癥組發(fā)現(xiàn)染色體核型異常4例，異常率為2.6%（4/151），包括染色體數(shù)目異常2例、染色體結(jié)構(gòu)異常2例；精液正常組未發(fā)現(xiàn)存在染色體核型異常，見表2。

表2 3組患者染色體核型異常情況（例）

2.3 3組患者性激素水平比較 3組患者FSH和LH水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中無精癥組、嚴(yán)重少精癥組FSH、LH水平均明顯高于精液正常組（均P＜0.05）；3組患者T和PRL水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 3組患者性激素水平比較

3 討論

在男性不育患者中，無精癥、嚴(yán)重少精癥占了較大的比例，臨床上常見的原因有染色體異常、內(nèi)分泌因素、外部環(huán)境因素、生殖道梗阻、睪丸病變、精索靜脈曲張等。精子的發(fā)生是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，減數(shù)分裂、有絲分裂均受到不同染色體的影響，當(dāng)染色體不正常、基因缺失時(shí)，易導(dǎo)致精子異常，嚴(yán)重降低精子質(zhì)量，最終影響生育功能。Y染色體微缺失、染色體核型檢測(cè)能反映出部分遺傳方面的原因，為男性不育患者的臨床診斷和治療提供新的路徑[4]。

在無精癥患者中，Y染色體的長臂常常缺失，這一現(xiàn)象最初由Tiepolo等[5]在1976年首次發(fā)現(xiàn)，經(jīng)進(jìn)一步研究后，該學(xué)者把位于Y染色體長臂1區(qū)1帶（Yq1.1）并參與調(diào)控精子生成的區(qū)段命名為AZF。隨后，Voget等[6]確定AZF的位置在Y染色體q臂第5、6區(qū)，基于此分成3個(gè)獨(dú)立區(qū)域，包括AZFa、AZFb、AZFc。而AZF區(qū)域片段的變化、缺少，被稱為Y染色體微缺失；這會(huì)影響精子形成，導(dǎo)致無精、少精等情況的發(fā)生，最終導(dǎo)致不育。Y染色體微缺失作為男性不育的第二大遺傳因素，其發(fā)生率僅次于Klinefelter綜合征。研究表明，無精癥或嚴(yán)重少精癥患者發(fā)生Y染色體微缺失的概率為2%～11%，某些地區(qū)表現(xiàn)出更高的發(fā)生率[7]。AZF區(qū)段的微缺失是不育的一個(gè)主要遺傳原因，因此對(duì)男性不育患者開展Y染色體微缺失檢測(cè)具有臨床意義。某研究對(duì)相關(guān)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后得出，Y染色體微缺失僅在 AZFa、AZFb、AZFbc、AZFc、AZFabc 等區(qū)域有相應(yīng)表現(xiàn)[8]。此外，一些新的缺失位點(diǎn)也逐漸被發(fā)現(xiàn)，如在AZFb與AZFc區(qū)域之間發(fā)現(xiàn)了新的缺失位點(diǎn)，即AZFd區(qū)域；但目前新發(fā)現(xiàn)區(qū)段的缺失在臨床上并無明確的臨床意義，它們常常伴隨其他區(qū)段缺失，而非獨(dú)立存在。到目前為止，在AZF區(qū)域中與精子的發(fā)生密切相關(guān)的候選基因尚未有報(bào)道，所以AZF區(qū)域缺失的臨床意義仍有較多的爭議[9]。

本研究選擇2013年版歐洲男科協(xié)會(huì)/歐洲分子遺傳質(zhì)量協(xié)作網(wǎng)關(guān)于Y染色體微缺失檢測(cè)指南推薦的6個(gè)位點(diǎn)，對(duì)362例患者的進(jìn)行AZF區(qū)域檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Y染色體微缺失率為7.7%，其中AZFb、AZFc、AZFbc、AZFabc位點(diǎn)缺失率分別為0.6%、5.8%、0.8%、0.6%?？梢?，AZFc位點(diǎn)缺失在不育患者中的發(fā)生率最高，具有各種臨床表型和組織學(xué)類型[10]。AZFc參與調(diào)控精原細(xì)胞向成熟精子的發(fā)生過程，這個(gè)區(qū)段的缺失通常會(huì)造成精子生成不足。有報(bào)道指出，在AZFc位點(diǎn)缺失的少精癥患者中，精子數(shù)目呈進(jìn)行性減少，臨床上最終進(jìn)展為無精癥。若患者少精且AZFc位點(diǎn)缺失，則需要提前冷凍保存精液。在AZFc位點(diǎn)缺失的無精癥患者中，約半數(shù)可以借助睪丸切開取精術(shù)（testicular sperm extraction，TESE）得到精子，并進(jìn)行單精子卵胞漿顯微注射輔助生育，然而由于Y染色體伴性遺傳的存在，這些患者的男性后代會(huì)獲得AZFc位點(diǎn)缺失，因此上述患者在行單精子卵胞漿顯微注射輔助生殖時(shí)，建議進(jìn)行優(yōu)生學(xué)上的性別干預(yù)[11-12]。AZFb、AZFbc位點(diǎn)缺失患者的睪丸組織學(xué)特點(diǎn)主要有精子阻滯引發(fā)無精癥或唯支持細(xì)胞綜合征，采取睪丸組織切取術(shù)仍無法得到精子。當(dāng)AZFb位點(diǎn)缺失時(shí)，會(huì)直接阻礙精原干細(xì)胞減數(shù)分裂期的發(fā)展，呈現(xiàn)生精阻滯，并伴隨各種臨床表現(xiàn)，精子多處于精母細(xì)胞階段、精子細(xì)胞階段。本研究結(jié)果顯示，AZFa位點(diǎn)單獨(dú)缺失情況并未出現(xiàn)。當(dāng)AZFa位點(diǎn)缺失時(shí)，患者的睪丸體積明顯縮小，不能產(chǎn)生精子，也不能通過顯微取精獲得精子，且出現(xiàn)唯支持細(xì)胞綜合征、無精癥的臨床表現(xiàn)。

在男性不育的原因中，染色體核型異常是另一個(gè)不可忽視的遺傳因素，目前最主要的染色體核型異常原因是Klinefelter綜合征。Klinefelter綜合征患者在有絲分裂階段、減數(shù)分裂階段，染色體聯(lián)會(huì)紊亂，性染色體不分離，形成含有兩個(gè)X的卵子，進(jìn)而對(duì)男性性狀基因產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)生一定的影響，最終表現(xiàn)出精子形成障礙、生殖器官發(fā)育不正常、激素水平不正常等。相關(guān)研究表明，Klinefelter綜合征涉及的主要染色體核型為47,XXY和47,XYY，還有一部分是嵌合型（46,XY/47,XXY和46,XX/47,XXY）[13]。對(duì)于染色體核型異?；颊?，應(yīng)通過細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)確定病因，積極尋求遺傳學(xué)咨詢并決定是否采取輔助生殖。

本研究還對(duì)男性不育患者的性激素水平作了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無精癥組、嚴(yán)重少精癥組FSH、LH水平均明顯高于精液正常組，而3組患者T和PRL水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pandey等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Y染色體微缺失的無精癥和嚴(yán)重少精癥患者LH及FSH水平明顯升高。下丘腦-垂體-睪丸性腺軸對(duì)男性睪丸生精能力具有調(diào)節(jié)、控制的作用，在促性腺激素釋放激素的作用下，腦垂體會(huì)生成LH、FSH。通過FSH的影響，促使精母細(xì)胞形成成熟的精子細(xì)胞；通過LH的影響，促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增生，提高間質(zhì)細(xì)胞水平，進(jìn)而形成精子。若生精上皮細(xì)胞未出現(xiàn)異常，來源于支持細(xì)胞的抑制素會(huì)發(fā)揮著抑制作用，降低FSH水平；若支持細(xì)胞-生精小管復(fù)合體出現(xiàn)異常，則抑制素的分泌水平會(huì)降低，負(fù)反饋減弱，導(dǎo)致FSH水平升高。LH、T分泌在下丘腦-垂體-睪丸性腺分泌軸內(nèi)分泌調(diào)控中是負(fù)反饋關(guān)系，當(dāng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞受損時(shí)，來源于間質(zhì)細(xì)胞分泌的T水平會(huì)降低，LH水平升高[15]?？梢姡瑱z測(cè)男性不育患者性激素水平變化，有助于判斷睪丸病理改變和功能狀態(tài)。對(duì)于一些非梗阻性無精癥患者，建議在TESE前進(jìn)行性激素水平檢測(cè)，若FSH高于正常值的2倍及以上則不建議行TESE。

綜上所述，無精癥和嚴(yán)重少精癥與Y染色體、染色體核型異常和性激素水平等具有密切聯(lián)系，但其相關(guān)機(jī)制十分復(fù)雜。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于一些無精癥和嚴(yán)重少精癥患者，可以借助TESE獲得精子并行單精子卵胞漿顯微注射輔助生殖。在開展輔助生殖治療時(shí)，建議聯(lián)合行Y染色體微缺失、染色體核型和性激素水平測(cè)定，為患者提供全方位的個(gè)性化遺傳咨詢。