吳秀怡，田清尹，楊秀蓮，岳遠征，王良桂

(南京林業(yè)大學 風景園林學院，南京 210037)

桂花(Osmanthusfragrans)是原產(chǎn)于中國的一種重要觀賞經(jīng)濟樹種?；ㄊ瞧渥钪匾挠^賞器官，具有形小繁多，芬芳馥郁，顏色豐富的特性[1]。同時，它富含多種有益于人體健康的營養(yǎng)元素，常用于配料制作各種中國傳統(tǒng)美食，在精油、洗護用品等化學工業(yè)中也擁有巨大的應用潛力[2-4]。桂花具有極高的開發(fā)利用價值，因此，研究參與調(diào)控桂花花朵開放過程中相關基因的作用機制及功能具有重要意義。

SPL(SQUAMOSA-promoter binding protein-like)基因是一個調(diào)控花發(fā)育過程的重要樞紐，僅存在于綠色植物中。SPL基因家族成員均含有由76個氨基酸殘基構成的SBP結構域，即兩個鋅指結構(Cys-Cys-His-Cys或Cys-Cys-Cys-Cys和Cys-Cys-Cys-His)和一個核定位信號(NLS)[5]。兩個鋅指結構通過結合鋅離子來維持蛋白質構象的穩(wěn)定，而核定位信號與第二個鋅指結構部分重疊，引導蛋白進入細胞核中進行轉錄調(diào)控[5]。SPL基因首次在金魚草中被發(fā)現(xiàn)[6]，之后又陸續(xù)從單細胞藻類到高等植物中被成功克隆出來[7-8]。目前，有關SPL基因家族的全基因組鑒定已在擬南芥[9-10]、水稻[11]、小麥[12]、矮牽牛[13]、麻風樹[14]和桃[15]中得到系統(tǒng)性的研究，其功能也被相繼報道。

在模式植物擬南芥中，共鑒定得到17個SPL基因家族成員，它們在參與調(diào)控擬南芥花朵開放過程中發(fā)揮至關重要的作用[9-10]。SPL基因可以調(diào)控植物的開花時間和花器官的生長，如過表達AtSPL3的擬南芥出現(xiàn)提前開花的現(xiàn)象并導致花序異常[16]，抑制AtSPL10的表達則會影響擬南芥花柄的伸長[17]。在花藥育性方面，過表達AtSPL8會降低擬南芥的育性[18]，它通過影響赤霉素生物合成和油菜素類固醇信號傳導起到正向的調(diào)控作用。此外，SPL基因還參與調(diào)控花色和花香物質的合成。MicroRNA156(miR156)通過調(diào)控AtSPL9破壞MYB-bHLH-WD40復合體的穩(wěn)定性來抑制二氫黃酮還原酶DFR(dihydroflavonol reductase)的表達，進而負調(diào)控花青素的生物合成[19]。同時，AtSPL9對倍半萜合成酶AtTPS21表達的調(diào)控可以促進擬南芥在開花階段形成(E)-b石竹烯等香氣物質[20]。

桂花花朵開放是一個較為特殊的生物學過程，它需要特殊的環(huán)境條件，如溫度、空氣濕度和光照等[21-22]。此外，不同品種的桂花在花朵開放過程中也有不同的作用機制，如色與香的合成過程及差異變化一直以來都是研究的熱點[23]。本研究基于課題組前期的桂花全基因組數(shù)據(jù)，鑒定得到29個SPL基因家族成員，系統(tǒng)分析了基因結構、系統(tǒng)發(fā)育關系和不同組織間表達模式，篩選出可能參與調(diào)控桂花花朵開放過程中的SPL基因，通過qRT-PCR技術分析SPL基因在花朵不同發(fā)育階段的表達情況，進行亞細胞定位和酵母自激活實驗的驗證，為解析SPL基因參與調(diào)控桂花花朵開放過程的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

以桂花‘日香桂’(O.fragrans‘Rixianggui’)品種為實驗材料，采自南京林業(yè)大學校園內(nèi)。采集時間為每日上午9：00～11：00，采集樣品為花朵開放過程中不同發(fā)育階段的花瓣：鈴梗期(S-1)、香眼期(S0)、初花期(S1)、盛花期(S2)和末花期(S3)，相鄰兩個花期間隔1～2 d(圖1)，每個花期3個生物學重復。所有樣品采集后立即放入液氮中速凍處理，并置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 方 法

1.2.1 桂花SPL基因家族成員鑒定從Pfam網(wǎng)站下載SPL家族的結構域模型文件(Pfam03110)，使用HMMER軟件從桂花全基因組數(shù)據(jù)庫中初步篩選出所有包含SPB結構域的蛋白序列[24]，利用Batch CD-search、Pfam和SMART這3個在線工具驗證其是否含有完整的SPB保守結構域。應用Weblogo3將SBP結構域可視化，運用ExPASy網(wǎng)站分析OfSPL蛋白序列的相對分子質量和理論等電點值，使用WoLF PSORT在線預測OfSPL蛋白的亞細胞定位。

1.2.2 桂花OfSPL生物信息學分析利用MEGA7.0軟件將OfSPL與AtSPL編碼的蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)，Poission模式、完全刪除和1000次重復進行測試，AtSPL的蛋白序列下載自Tair官網(wǎng)。在桂花全基因組GFF3文件中提取OfSPL的染色體信息(染色體長度和基因的起始、終止位點)繪制染色體定位圖。使用TBtools獲取桂花SPL基因家族成員的基因結構信息并進行基因結構的可視化展示。

S-1. 鈴梗期；S0. 香眼期；S1. 初花期；S2. 盛花期；S3. 末花期圖1 桂花花朵開放的不同發(fā)育階段S-1. Bud-pedicel stage; S0. Bud-eye stage; S1. Primary blooming stage; S2. Full blooming stage; S3. Flower fading stageFig.1 Different flower development stages of O. fragrans flower opening

1.2.3 桂花不同組織及花發(fā)育不同階段表達分析基于桂花全基因組的RNA-seq表達數(shù)據(jù)得到7個不同組織(根、莖、幼葉、成熟葉、初花期、盛花期和末花期)的FPKM值，進行SPL基因家族成員的表達分析。利用TBtools完成表達熱圖的繪制，篩選出在花組織中較高表達的SPL基因。

按照天根植物總RNA提取試劑盒的說明提取桂花花朵不同發(fā)育階段的RNA，采用EasyScript一步法反轉錄試劑盒完成cDNA的合成，并用去離子水稀釋10倍。使用Primer 5.0軟件設計OfSPL的特異性引物，以桂花RAN為內(nèi)參基因進行實時熒光定量[25-26]。測定結果均為3次生物學和3次技術性重復的平均值±SE，利用SPSS(22.0)統(tǒng)計軟件進行方差分析和差異顯著性比較。

1.2.4OfSPL10/21候選基因亞細胞定位及酵母自激活為了構建35S∷GFP-OfSPL10/21，將OfSPL10/21的CDS序列克隆到pCAMBIAsuper1300-GFP載體上。采用攜帶35S∷GFP-OfSPL10/21農(nóng)桿菌(GV3101)及對照載體注射本氏煙草葉片進行瞬時表達分析。待浸潤植株于生長室正常培養(yǎng)2 d后，在德國Zeiss公司的LSM710顯微鏡上觀察綠色熒光蛋白(GFP)熒光信號。

將OfSPL10/21的CDS序列克隆到pGBKT7載體獲得pGBKT7-OfSPL10/21，再將pGBKT7-OfSPL10/21和陰性對照pGBKT7轉化到酵母AH109菌株上，并于SD/-Trp、SD/-Trp-ade和SD/-Trp-ade+X-α-gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d(30 ℃)后觀察變化。

2 結果與分析

2.1 OfSPL基因家族成員鑒定

基于桂花全基因組數(shù)據(jù)，共鑒定得到29個OfSPL家族成員，根據(jù)其在染色體上的位置，依次命名為OfSPL1—OfSPL29(表1)，它們不均勻地分布在桂花15條染色體上(圖2)。29個OfSPL家族成員均含高度保守的SBP結構域(圖3)。此外，OfSPL10/17/21/22蛋白序列還包含ANK結構域，OfSPL11包含RRM結構域。29個OfSPL蛋白分子量從15.053 kD跨度到119.887 kD，最長的OfSPL19含有1 088個氨基酸，而最短的OfSPL2僅有133個氨基酸，理論等電點分布在6.16～9.83之間。

2.2 OfSPL系統(tǒng)發(fā)育和基因結構分析

為了解桂花SPL基因的系統(tǒng)進化關系，將29個桂花SPL蛋白和16個擬南芥SPL蛋白構建系統(tǒng)進化發(fā)育樹。結果顯示，29個桂花SPL蛋白聚為8個亞群，每個亞群分別含有7、6、10、4、6、9、3和1個蛋白，其中桂花OfSPL分別為4、3、7、3、3、5和2個。除了亞群8，每個亞群至少包含1個AtSPL和1個OfSPL(圖4，表2)。為進一步研究桂花SPL基因的系統(tǒng)進化關系，對其外顯子、內(nèi)含子的基因結構進行分析?；蚪Y構分析結果顯示，不同組的外顯子數(shù)量存在差異，但在同一組中幾乎一致，共分為7個組G1—G7(圖5)。

2.3 OfSPL不同組織表達模式及花發(fā)育不同階段分析

從桂花7個不同組織樣本的RNA-seq表達數(shù)據(jù)中獲得24個OfSPL的FPKM值(圖6)，5個OfSPL(OfSPL1/2/6/20/27)未找到表達量。結果顯示，24個OfSPL在不同組織中的表達模式不同，其成員之間表達存在較大差異。亞群6中OfSPL10/17/19/21/28、亞群2中OfSPL9、亞群3中OfSPL7/16/25、亞群4中OfSPL18、亞群5中OfSPL8和亞群7中OfSPL27在不同組織中均有表達，其中，OfSPL9/10/17/18/19/21/27/28這8個基因在花組織中的整體表達量較高。

為了探究OfSPL在桂花花朵開花過程中的潛在功能，對OfSPL10/21在桂花花朵不同發(fā)育階段S-1～S3進行qPCR技術分析。結果顯示，OfSPL10/21在花朵不同發(fā)育階段均有不同程度的表達，OfSPL10/21的相對表達量隨著花朵逐漸開放基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖7)。

表1 桂花OfSPL基因家族成員

2.4 OfSPL10/21蛋白的亞細胞定位及酵母自激活

使用WoLF PSORT在線預測OfSPL蛋白的亞細胞定位，OfSPL10/21均主要定位于細胞核上。為進一步驗證其編碼蛋白的亞細胞位置，在本氏煙草中進行35S∷GFP-OfSPL10/21亞細胞定位實驗，探究OfSPL10/21基因在轉錄調(diào)控系統(tǒng)中的潛在功能。結果顯示，35S∷GFP-OfSPL10/21融合蛋白的綠色熒光信號在細胞核和細胞質膜上能夠被明顯地觀測到(圖8)，表明OfSPL10/21蛋白主要定位在細胞核中。

為了進一步確定OfSPL10/21的轉錄激活功能，將篩選出的OfSPL10/21序列克隆到酵母表達載體pGBKT7中。陰性對照pGBKT7和pGBKT7-OfSPL10/21在連續(xù)稀釋的SD/-Trp培養(yǎng)基上生長良好，在SD/-Trp-Ade和SD/-Trp-ade+X-α-gal培養(yǎng)基上均不能正常生長(圖9)。

左側比例尺表示染色體長度圖2 桂花SPL的染色體定位The scale on the left provides the relative length of chromosomesFig.2 Chromosomal localization of SPLs in O. fragrans

表2 擬南芥SPL基因家族成員登錄號

Of. 桂花；At. 擬南芥圖4 桂花SPL基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析Of. Osmanthus fragrans； At. Arabidopsis thalianaFig.4 Phylogenetic analysis of SPL gene family in O. fragrans

圖例表示標準化的FPKM值。紅色表示高表達水平，綠色表示低表達水平圖6 桂花SPL基因家族不同組織及花期中的差異表達Legends represent the normalized FPKM values. Red means high expression level, while green means low expression levelFig.6 Differential expression of SPL family in different tissues and flowering stages of O. fragrans

圖5 桂花SPL基因家族的基因結構分析Fig.5 Analysis of gene structure of SPL gene family in O. fragrans

不同小寫字母表示基因表達量存在顯著性差異(P<0.05)圖7 OfSPL10/21基因在桂花花朵不同發(fā)育階段的表達Different lowercase letters indicate significant difference in gene expression (P<0.05)Fig.7 Expression levels of OfSPL10/21 in different flower development stages of O. fragrans

3 討 論

SPL是植物特有的具有高度保守SBP結構域的特異性家族，在花朵開放過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。迄今為止，有關SPL基因的研究在模式植物中取得了很大進展，但對大多數(shù)木本觀賞植物的報道較少。SPL基因家族成員可聚類為8個亞群[9-11]，在有的研究中也被分為6個亞群[27-28]。本研究通過桂花全基因組共鑒定出29個OfSPL家族成員，根據(jù)8個亞群的分類方法分到其中7個亞群中，第8亞群不含SPL基因。大部分OfSPL與AtSPL同源性極高并歸為同一亞群，且具有相似的外顯子/內(nèi)含子結構，該結果與桃SPL基因家族成員的基因結構分布情況較吻合[15]。由此，我們推測同一亞群中桂花OfSPL和擬南芥AtSPL可能具有相似的生物學功能。

激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長的設置為：GFP.500 nm(綠色)；葉綠體.400 nm(紅色)圖8 OfSPL10/21蛋白在本氏煙草表皮細胞中的亞細胞定位The excitation wavelength of the confocal laser microscope was set as GFP. 500 nm (green). Chloroplasts. 400 nm (red)Fig.8 Subcellular localization of OfSPL10/21 in the epidermal cells of Tobacacia benzoi

圖9 OfSPL10/21在酵母中的轉錄自激活活性分析Fig.9 Transactivation analysis of OfSPL10/21 in yeast cells

基因在植物中的表達決定其功能，基因的表達模式反映了其功能[13]。大多數(shù)OfSPL在不同的組織中表達不同，說明OfSPL在桂花生長發(fā)育過程中參與了多個生物學過程。已有研究報道，同一亞群中大多數(shù)同源SPL基因具有相似的表達模式[29]。在桂花中，屬于第6亞群的5個基因OfSPL10/17/19/21/28幾乎在所有組織中都較高表達，其余亞群中大部分OfSPL都較低表達，這與椰子SPL基因家族成員的表達情況一致[30]。OfSPL9/10/17/18/19/21/28/27在花組織中較高表達，推測這8個基因可能參與了桂花花朵開放的過程。其中，OfSPL10在所有組織中的表達量都極高，它可能在桂花生長中起著至關重要的作用。有報道同源基因AtSPL1和AtSPL12在擬南芥花序中的高表達增強了花序的耐熱性[31]。在本研究中，OfSPL10/21的表達趨勢和桂花花香物質的釋放及花色呈色的規(guī)律一致[23,32]，由此推測其可能參與調(diào)控花色與花香物質的生物合成。

許多研究表明，具有轉錄激活活性的轉錄因子通常定位于細胞核中發(fā)揮調(diào)控作用[33]，如枸杞LbSPL6基因在細胞核上調(diào)控下游基因的表達[34]。在桂花中，OfSPL10/21定位于細胞核，說明它們可以在細胞核中發(fā)揮活性。然而，部分轉錄因子并非特異定位在細胞核上，它們可能在一定的誘導狀態(tài)下才能轉移到細胞核中發(fā)揮功效，如膜定位的MfNACsa在干旱脅迫下會轉移到細胞核中[35]，或者與其他基因發(fā)生互作，其位置也會受到影響[36]。轉錄自激活分析顯示，OfSPL10/21不具有轉錄自激活活性，因此，我們推測它們可能與其他基因發(fā)生相互作用。

本研發(fā)現(xiàn)，OfSPL9/10/17/18/19/21/27/28可能參與了桂花花朵開放的過程，推測OfSPL10/21可能參與調(diào)控桂花花色與花香物質的生物合成。通過亞細胞定位和酵母自激活驗證，發(fā)現(xiàn)OfSPL10/21主要定位在細胞核上，推測它們可能需要與其他基因發(fā)生互作才能發(fā)揮調(diào)控作用。本研究為進一步探究SPL基因參與桂花花朵開放過程中的作用機制提供了基因資源。