許敏玲， 陳 桃， 蔡 琪

南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，中山 528415

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematous，SLE)是一種慢性的自身免疫性疾病，表現(xiàn)為T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的功能異常，并有自身抗體的產(chǎn)生。流行病學(xué)研究和全基因組關(guān)聯(lián)分析都顯示了SLE具有顯著家族遺傳傾向[1]。在人類基因組上廣泛存在與逆轉(zhuǎn)錄病毒同源的DNA序列，被命名為人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(human endogenous retroviruses，HERVs)序列。大部分HERVs序列大約在1000萬年～5000萬年前開始出現(xiàn)在人類基因組中，這些內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列不產(chǎn)生感染性病毒，過去這些序列被認為是垃圾DNA。然而，越來越多的研究證實它們的異常表達與腫瘤、自身免疫性疾病等相關(guān)[2-4]。HERVs序列活化產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能在自身免疫性疾病如SLE的發(fā)病中起重要作用[4-6]。在眾多HERVs序列中，HRES1(HTLV-I-related endogenous retroviral sequence，HRES1)是首個被發(fā)現(xiàn)的可表達病毒蛋白的序列，也是大多數(shù)HERVs的原型。與其它HERVs序列不同，HRES1序列僅有1個拷貝，位于人類染色體1q42。在HRES1正反義序列中具有多個開放讀碼框。其中正義鏈上具有編碼28 kD核蛋白(HRES1/p28)的轉(zhuǎn)錄子；而在反義鏈中HRES1序列可編碼Rab4a基因，被命名為HRES1/Rab4。近年來在SLE患者血清中發(fā)現(xiàn)了HRES1/p28的表達增加[7]，患者血清與HRES1/p28表達的同源多肽具有交叉抗原反應(yīng)[8-10]。然而，HRES1/p28的表達與SLE病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性仍然未知，尤其在中國漢族人群中，尚未見任何相關(guān)報道。本研究通過檢測SLE患者外周血單核細胞(peripheral blood monouclear cell，PBMC)中HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平，探索漢族人群SLE患者HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平改變與臨床表征的相關(guān)關(guān)系，為SLE的診斷、治療、預(yù)后判斷等提供線索。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為2016年11月至2019年12月間南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院門診和住院收治的SLE患者，共計47例，所有病例均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ARA)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有SLE患者均進行了常規(guī)臨床癥狀調(diào)查、檢測指標(biāo)的測定，并根據(jù)2000年改進的SLE疾病活動指數(shù)(SLE-DAI-2000)評分法評價SLE患者疾病活動程度[11]。其中活動期患者20例，診斷依據(jù)為典型的臨床表現(xiàn)、異常的實驗室指標(biāo)及SLE-DAI≥10分；非活動期患者17例，SLE-DAI為5～9分；緩解期患者10例，SLE-DAI為0～4分。另選取13例健康體檢者的抗凝外周靜脈血標(biāo)本作為對照組，均排除SLE、其他自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病，其中女性12例，男性1例，年齡(32.3±5.2)歲，性別、年齡結(jié)構(gòu)與入組SLE患者無顯著差異。研究對象全部知情同意并簽署知情同意書，醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)開展此項研究。

1.2 臨床資料

采集每位患者的病史、體檢和實驗室檢查資料，見表1。其中臨床表現(xiàn)記錄關(guān)節(jié)炎、盤狀皮損、蝶形紅斑、光敏、腎臟損害、血管炎等。實驗室檢查包括血細胞分析、尿液分析、自身抗體[包括抗核抗體(ANA)、抗dsDNA抗體、抗Sm抗體]以及IgG、C3和C4。根據(jù)臨床表現(xiàn)和實驗室檢查判斷是否存在皮膚、關(guān)節(jié)和腎臟損害。合并皮膚損害定義為至少有1項皮膚病變指標(biāo)(包括盤狀皮損、蝶形紅斑、光敏)；合并關(guān)節(jié)損害定義為至少有1項關(guān)節(jié)病變的臨床指標(biāo)(包括關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、變形及周圍軟組織腫脹等癥狀，或關(guān)節(jié)病變的影像學(xué)診斷)；合并腎臟損害定義為至少有1項異常檢測指標(biāo)(包括血肌酐、血尿素、尿紅細胞和尿蛋白)。

表1 入組SLE患者的臨床表征Table 1 Demographic and clinical characteristics of SLE patients

1.3 外周血淋巴細胞的分離和RNA提取

抽取SLE患者和正常人外周血6 mL，EDTA抗凝，取4 mL緩慢加入淋巴細胞分離液(達科為公司產(chǎn)品)中，采用Ficoll密度梯度離心法分離中間層PBMC，轉(zhuǎn)入離心管，-80 ℃保存?zhèn)溆?。細胞總RNA的提取采用Qiagen RNA mini kit試劑盒(科海生物提供)，根據(jù)說明書進行，抽提的總RNA以DNaseⅠ消化，再以氯仿-異丙醇提取，得到的RNA以DEPC水溶解。用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度，用凝膠電泳法檢測RNA的完整性。

1.4 HRES1/p28基因表達的檢測

將提取總的RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)進行反轉(zhuǎn)錄。取1 μL提取的RNA以O(shè)ligo dT進行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，75 ℃ 15 min，反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA于-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用SYBR試劑(日本TaKaRa公司)進行實時定量PCR反應(yīng)，采用7500 Real-time PCR System(美國ABI公司)檢測HRES1/p28基因的轉(zhuǎn)錄水平，以β-actin為內(nèi)參照。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。HRES1/p28：正向引物5′-GGAAGAGGAGATGGGCTACG-3′；反向引物5′-CAGGGAAATCGGGACTCAG-3′，產(chǎn)物193 bp。β-actin：正向引物5′-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′；反向引物5′-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′，產(chǎn)物156 bp。PCR反應(yīng)擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，50個循環(huán)(94 ℃，變性30 s；55 ℃，退火30 s；72 ℃，延伸30 s)。每輪PCR反應(yīng)重復(fù)2次。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照，采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示標(biāo)本中HRES1/p28基因相對表達量。為了顯示與正常健康對照組的變化比例，所有HRES1/p28相對表達量值被除以正常對照組的均值，進行標(biāo)準(zhǔn)化計算。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)測定血漿中細胞因子濃度

取EDTA抗凝外周血，離心取上清，-80 ℃分裝保存。采用雙抗體夾心ELISA法檢測細胞因子(包括IFNγ、IP-10、TNFα、IL-1β)，試劑盒購自荷蘭HyCult Biotechnology公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行檢測，設(shè)立雙標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣本中各細胞因子濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HRES1/p28基因在SLE患者和健康對照組PBMC的轉(zhuǎn)錄水平

反轉(zhuǎn)錄PCR顯示HRES1/p28基因在健康對照組和SLE患者組的PBMC細胞中均有表達。通過定量PCR測定HRES1/p28基因的轉(zhuǎn)錄水平，與健康對照組相比，SLE患者的轉(zhuǎn)錄水平增高至146.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004，圖1)。利用ROC曲線評價HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平對SLE診斷的意義，結(jié)果顯示ROC曲線下面積為(0.751±0.088)(P<0.01)，提示HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平測定對SLE具有診斷意義(圖2)。

圖1 熒光定量PCR檢測SLE患者PBMC的HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.1 Quantification of the HRES1/p28 mRNA expression in the PBMCs isolated from SLE patients using real-time PCR

圖2 HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平對診斷SLE的ROC曲線分析Fig.2 ROC curve analysis of the HRES1/p28 mRNA expression level in SLE patients

2.2 SLE患者PBMC的HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平與SLE活動指數(shù)的關(guān)系

按病情活動指數(shù)將患者分為3組：緩解組(SLE-DAI 0～4分)，非活動組(SLE-DAI 5～9分)和活動組(SLE-DAI≥10分)。SLE活動組的HRES1/p28基因相對轉(zhuǎn)錄水平顯著高于健康對照組、緩解組以及非活動組(均P<0.01，圖3A)，而非活動組、緩解組和健康對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。將SLE組PBMC的HRES1/p28基因相對轉(zhuǎn)錄水平與SLE活動指數(shù)制作散點圖(圖3B)，顯示二者具有正相關(guān)關(guān)系(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.678，P<0.01)。

A：不同SLE活動指數(shù)患者HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平的比較；B：線性回歸分析SLE活動指數(shù)與HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)關(guān)系圖3 SLE病情活動度與PBMC細胞HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系Fig.3 Relationship between SLE-DAI and the HRES1/p28 mRNA expression level in the PBMCs

2.3 HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平與血漿細胞因子濃度的關(guān)系

利用ELISA測定健康對照組和SLE組血漿IFNγ、IP-10、TNFα、IL-1β的濃度。如圖4所示，健康對照組和SLE組的細胞因子濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。然而，根據(jù)測定HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平的中位數(shù)值將健康對照組和SLE組進一步分為HRES1/p28高表達組和低表達組，我們發(fā)現(xiàn)SLE患者中HRES1/p28高表達組的血漿IP-10和TNFα濃度均顯著高于RES-1/p28低表達組(均P<0.01)。對SLE患者和健康對照組的整體數(shù)據(jù)進行Pearson相關(guān)分析顯示血漿IP-10和TNFα濃度與HRES1/p28轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖5)，提示HRES1/p28轉(zhuǎn)錄水平與血漿IP-10和TNFα濃度呈正相關(guān)關(guān)系。為了進一步比較SLE患者中不同細胞因子濃度與HRES1/p28轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)聯(lián)度，我們進行多元線性回歸分析。多元線性回歸顯示具有良好的擬合優(yōu)度(確定系數(shù)R2=0.533)，影響SLE患者HRES1/p28轉(zhuǎn)錄水平的主要細胞因子依次為血漿IP-10、TNFα和IFNγ濃度(偏相關(guān)系數(shù)分別為0.553、0.369和0.345，均P<0.05，表2)。

依HRES1/p28表達中位數(shù)值將健康對照組和SLE組進一步分為HRES1/p28高表達組和低表達組，分別利用兩獨立樣本t檢驗比較組間血漿細胞因子IFNγ(A)、IP-10(B)、TNFα(C)、IL-1β(D)的濃度；a：健康對照組與SLE組比較圖4 血漿中細胞因子濃度與PBMC中HRES1/p28轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性Fig.4 Relationship between plasma cytokine levels and the HRES1/p28 mRNA expression level in the PBMCs

圖5 線性回歸分析血漿細胞因子IP-10(A)、TNFα(B)與PBMC表達HRES1/p28的相關(guān)性Fig.5 Linear regression analysis between plasma IP-10(A)/TNFα(B) levels and the HRES1/p28 mRNA expression level in the PBMCs

表2 多元線性回歸分析SLE患者HRES/p28轉(zhuǎn)錄水平與不同血漿細胞因子的關(guān)聯(lián)度Table 2 Association between concentration of different serum cytokines and the HRES1/p28 mRNA expression level analyzed by multiple linear regression

2.4 SLE患者臨床表征與HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系

將SLE患者按照多系統(tǒng)損害的特征和抗體檢測結(jié)果進行分層研究，探討HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平改變是否存在特異性的改變。如表3所示，根據(jù)臨床特征歸類和抗體陽性指標(biāo)進行比較，結(jié)果顯示SLE組中具有關(guān)節(jié)病變特征的患者，其PBMC細胞的HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于無關(guān)節(jié)病變的患者(P<0.01)，腎臟損害陽性組也顯著高于陰性組(P<0.01)。抗dsDNA、抗Sm抗體、補體和IgG的陽性患者PBMC細胞的HRES1/p28基因轉(zhuǎn)錄水平與陰性患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表3 不同臨床表征分組患者HRES1/p28 mRNA表達的差異Table 3 Differences in the HRES1/p28 mRNA expression between the subgroups of SLE patients classified with specific clinical manifestation

3 討論

SLE屬于多因素復(fù)雜性的疾病，其病因復(fù)雜，涉及多種環(huán)境和遺傳因素，然而其遺傳本質(zhì)至今尚不清楚。有研究認為，免疫系統(tǒng)表觀遺傳穩(wěn)態(tài)的紊亂可引起基因異常表達，進一步引發(fā)免疫功能紊亂和加劇免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[1，12]。HERVs序列源于病毒，表達的蛋白與病毒蛋白具有一定相似性。病毒感染形成的抗體與內(nèi)源性表達的HERVs蛋白可形成交叉免疫反應(yīng)。因此，HERVs序列活化可能在自身免疫性疾病如SLE的發(fā)病中起重要作用[4，13-15]。以往的研究在SLE患者的器官和血清中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒成分的抗原、抗體[3，8]；電鏡觀察SLE患者的器官可發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒[1]；而逆轉(zhuǎn)錄病毒成分可以誘導(dǎo)出SLE樣的免疫異常[5]。這些研究結(jié)果提示HERVs的活化表達是SLE發(fā)病的重要機制之一。

HRES1序列屬于HERVs，但具有一定的獨特性。HRES1基因序列活化也可能參與SLE的發(fā)病過程。近年研究中多個證據(jù)顯示HRES1與SLE相關(guān)，其中包括：①HRES1編碼蛋白p28(HRES1/p28)被發(fā)現(xiàn)與SLE的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，52%的SLE患者血清被發(fā)現(xiàn)具有抗HRES1的抗體，而在正常人群中僅有3.6%的陽性率[2，8，10]；②HRES1的反義鏈可編碼HRES1/Rab4蛋白，可調(diào)節(jié)CD4的細胞表面表達，HRES1/Rab4蛋白在SLE患者中表達顯著增加[16]；③有研究顯示HRES1的長末端重復(fù)序列(LTR)和啟動子區(qū)域的多態(tài)性與SLE相關(guān)[7，17]；④HRES1位于SLE相關(guān)基因的熱點區(qū)域(染色體1q42)[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)在分離的PBMC細胞中，SLE患者的HRES1/p28轉(zhuǎn)錄水平較健康對照組顯著增高(P<0.01)，結(jié)果與既往在SLE患者B淋巴細胞所發(fā)現(xiàn)的HRES1/p28表達增高一致[7]。然而，由于HRES1/p28序列編碼的病毒樣蛋白特異性低，表達量少，無法檢測[16，19]，現(xiàn)有研究僅發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的表達增加。SLE患者中HRES1/p28的表達水平增高，可能與抗HRES1的自身抗體形成有關(guān)[7]。位于HRES1基因的LTR是HRES1重要的啟動子區(qū)域，研究顯示，SLE患者在HRES1基因LTR上的低甲基化與HRES1/p28的表達水平增高有關(guān)[7]。近年來的研究結(jié)果表明，免疫細胞DNA的普遍低甲基化參與自身免疫的發(fā)生，與SLE的發(fā)病密切相關(guān)。SLE的病情與DNA甲基化水平、DNA轉(zhuǎn)甲基酶表達和促分裂原活化蛋白激酶系統(tǒng)活性相關(guān)[1，14，20]。本研究發(fā)現(xiàn)SLE活動指數(shù)與HRES1/p28的轉(zhuǎn)錄水平具有一定的正相關(guān)關(guān)系，活動期的表達顯著高于非活動期，進一步提示HRES1/p28的表達與SLE的病情相關(guān)。SLE患者組織損傷和功能失調(diào)被認為主要通過免疫復(fù)合物的沉積，并誘導(dǎo)多種活性介質(zhì)(譬如細胞因子)的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)HRES1/p28轉(zhuǎn)錄水平增高不但與SLE活動指數(shù)呈正相關(guān)，還與趨化因子IP-10、TNFα具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。趨化因子IP-10又稱干擾素誘導(dǎo)蛋白，是由IFNγ誘導(dǎo)T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突細胞等分泌，具有促進炎癥細胞和淋巴細胞募集、介導(dǎo)多種細胞因子的作用。在HRES1/p28 mRNA的高表達組IP-10顯著增高，而IFNγ也具有增高的趨勢。針對漢族人群中的SLE患者的細胞因子檢測中也發(fā)現(xiàn)以IP-10增高最為顯著[21]。血漿細胞因子的濃度與多種因素有關(guān)，既往研究顯示血漿IP-10、TNFα的濃度與SLE病情活動情況有關(guān)[22]。與上述結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)SLE病情活動狀態(tài)與細胞因子IP-10、TNFα的增高具有顯著的相關(guān)性，并與HRES1/p28 mRNA水平的增高也顯著相關(guān)。我們推測HRES1/p28的過度表達可能促進抗HRES1/p28自身抗體的形成，誘發(fā)免疫應(yīng)答和細胞因子釋放，是SLE發(fā)病機制之一。HRES1/p28過度表達相關(guān)的SLE可能具有特定的臨床特征。對SLE的臨床資料進行分層分析，我們比較皮膚損害、關(guān)節(jié)病變、腎臟損害和不同抗體陽性分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)損害、腎臟損害與HRES1/p28的表達相關(guān)。既往研究顯示，SLE患者血清中抗HRES1自身抗體與抗RNP抗體的出現(xiàn)具有相關(guān)關(guān)系，而抗HRES1抗體陽性的SLE患者往往呈現(xiàn)Sm、Ro、La抗體陰性[8]，提示抗HRES1自身抗體產(chǎn)生可能是SLE的獨立病因之一。此外，在HRES1單核苷酸多態(tài)型(SNP)研究中也發(fā)現(xiàn)，HRES1基因型在SLE患者中分布具有顯著的傾向性。不同的基因型與SLE患者的臨床表現(xiàn)具有一定的相關(guān)關(guān)系[23]。HRES1的位點653C/1259C基因型與腎臟損害具有相關(guān)關(guān)系，而與神經(jīng)系統(tǒng)損害、皮膚損害、關(guān)節(jié)損害無關(guān)[17，24-25]。HRES1的表達具有顯著的組織和細胞特異性，不同組織細胞的HRES1表達差異可能是導(dǎo)致系統(tǒng)選擇性損害的原因。

雖然越來越多的研究顯示HRES1與SLE的發(fā)生具有密切的聯(lián)系，然而HRES1的表達調(diào)控錯綜復(fù)雜，抗HRES1抗體的形成需要不同的基因背景和環(huán)境條件。有關(guān)HRES表達與SLE關(guān)系仍不清楚。本研究在漢族人群中證實了在SLE患者中HRES1的轉(zhuǎn)錄水平增高，并且與SLE的病情活動程度、血漿細胞因子水平具有正相關(guān)關(guān)系，而且主要發(fā)生在具有關(guān)節(jié)病變和腎臟損害的SLE患者中。然而，HRES1的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達，抗HRES1/p28抗體的相關(guān)關(guān)系，以及組織差異性等問題仍有待進一步的研究。