艾灸神闕穴對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠TLRs∕NF-κB通路相關(guān)因子表達(dá)的影響*

薛 瑩 穆韻濃 趙百孝

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100000；2.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100000；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100000）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）發(fā)病于大腸黏膜及黏膜下層，臨床癥狀為發(fā)熱、腹痛、腹瀉及膿血便等[1]，是公認(rèn)的難治性腸病之一，近年來在亞洲各國(guó)的發(fā)病率逐年上升[2]。UC作為病因未明確的非特異性炎癥性疾病，探究與其炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的信號(hào)通路與療效研究尤其重要。研究表明，TLRs∕NF-κB通路可聯(lián)系先天性免疫與獲得性免疫，對(duì)炎癥、感染性疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。在UC患者腸黏膜中，Toll樣受體（TLRs）表達(dá)異常升高，TLRs∕NF-κB通路被激活，從而釋放白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子，產(chǎn)生并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[3-4]。艾灸作為傳統(tǒng)的綠色療法之一，可從免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌[5]等多途徑防治疾病。多項(xiàng)研究表明艾灸對(duì)炎性反應(yīng)具有調(diào)控作用，如降低炎性反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)人體免疫等[6-10]。本研究選取Toll樣受體4（TLR4）、核因子-κB p65（NF-κB p65）與TNF-α為代表性指標(biāo)，觀察艾灸神闕穴對(duì)UC小鼠TLRs∕NF-κB通路的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

32只健康雄性ICR小鼠，體質(zhì)量（21±2）g，購(gòu)自維通利華（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK（京）2016-0038。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑

特制細(xì)艾條（河南南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限公司，規(guī)格：0.5 cm×20 cm）；DSS（MP Biomedicals，Q1723）；美沙拉秦緩釋顆粒劑（上海愛的發(fā)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20143164）；TLR4（S441）polyclonal antibody（Bioworld，BS3489）；TNF-α polyclonal antibody（Bioworld，BS6000）；NF- κB p65 polyclonal antibody（Bioworld，BS90940）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光顯微鏡（OLYMPUS）；小鼠固定器（上海華巖儀器設(shè)備有限公司，規(guī)格：150 mm×65 mm×50 mm）；便潛血試劑盒[中農(nóng)博信（北京）科技有限公司]；石蠟包埋機(jī)（LEICA，EG 1160）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，50X）；高速冷凍離心機(jī)（Beckman）；凝膠成像儀：Bio-Sens SC 810B（上海山富科學(xué)儀器有限公司）；實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI7500）。

1.4 造模與分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將32只小鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、美沙拉嗪組和艾灸組，每組8只。除空白組飲用無(wú)菌水外，其他各組飲用3.5%葡聚糖硫酸鈉（DDS）溶液7 d進(jìn)行造模，至第8天全部恢復(fù)飲用無(wú)菌水，并開始相應(yīng)干預(yù)。

1.5 干預(yù)方法

艾灸組：將小鼠放入固定器內(nèi)固定，利用固定器下方橢圓形孔暴露其腹部，使用固定支架架起固定器，在小鼠神闕穴下方3 cm處進(jìn)行艾灸，每次20 min，每日1次，艾灸過程中將艾條燃燒處與神闕穴的距離維持在3 cm以確保其溫度恒定。美沙拉嗪組：按0.4 g∕kg給予美沙拉嗪溶液，每日1次?？瞻捉M和模型組：除艾灸外其他操作同艾灸組。共干預(yù)7 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

末次干預(yù)后，禁食不禁水12 h。每組隨機(jī)選取6只小鼠取材。采用3.5%水合氯醛0.1 mL∕10 g腹腔注射麻醉后剖開腹部，自恥骨聯(lián)合處至盲腸取下整段結(jié)腸，一部分固定于4%多聚甲醛固定液中，剩余部分置于液氮1 h后移至-80℃冰箱保存。

1.6.1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)估 每日同一時(shí)間記錄各組小鼠的體質(zhì)量、大便和便隱血情況。參照文獻(xiàn)中經(jīng)典評(píng)分方法[11]，結(jié)合體質(zhì)量下降情況、大便性狀及是否便血進(jìn)行DAI評(píng)分。

1.6.2 結(jié)腸組織HE染色 將結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染料染色，脫水封固后，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.6.3 結(jié)腸組織NF-κB、TLR-4、TNF-α的免疫組化檢測(cè) 取0.5 cm病變較明顯的部位，常規(guī)固定、包埋、切片，石蠟切片脫蠟至水洗。免疫組織化學(xué)采用SP法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，TLR4陽(yáng)性表達(dá)于胞膜和胞質(zhì)，NF-κB p65為胞核和胞質(zhì)著色，觀察結(jié)腸組織各層陽(yáng)性細(xì)胞分布特征，平均光密度值進(jìn)行比較評(píng)估。

1.6.4 結(jié)腸組織NF-κB、TLR-4、TNF-α的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 取小鼠結(jié)腸組織，抽提總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒（SYBR Premix Ex TaqⅡ）操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；加入上、下游引物，反應(yīng)條件：用SYBR PCR Mixture進(jìn)行擴(kuò)增：pre-incμbation，95 ℃ 2 min；Amplification（40 cycles），95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s；Melting Cμrves，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。用 ABI7500熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況

空白組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)，大便正常，毛發(fā)亮澤；造模后其他組出現(xiàn)腹瀉、便血或膿血現(xiàn)象，活動(dòng)、飲食均減少，且體質(zhì)量減輕、毛發(fā)粗糙凌亂、精神萎靡；干預(yù)后艾灸組與美沙拉嗪組體質(zhì)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但艾灸組較緩于美沙拉嗪組，這可能與實(shí)驗(yàn)束縛有關(guān)，艾灸組大便性狀恢復(fù)趨勢(shì)較好，艾灸2～3 d大部分鼠已由稀便轉(zhuǎn)至基本正常，同時(shí)兩組腹瀉、便血情況得到改善，活動(dòng)量增加。

2.2 各組小鼠DAI評(píng)分比較

見表1。造模后，部分小鼠第2天即出現(xiàn)便潛血陽(yáng)性，隨即陸續(xù)出現(xiàn)稀便伴血甚至膿血便癥狀，體質(zhì)量下降。干預(yù)后，艾灸組與美沙拉嗪組相關(guān)癥狀均改善。與空白組相比，模型組的DAI評(píng)分顯著增高（P＜0.05）；與模型組相比，艾灸組DAI評(píng)分減少（P＜0.05）。

表1 各組小鼠DAI評(píng)分比較（±s）

表1 各組小鼠DAI評(píng)分比較（±s）

組別空白組模型組美沙拉嗪組艾灸組n6 6 6 6 DAI評(píng)分0.14±0.11 4.83±0.51△2.44±0.56*2.28±0.49*

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化

空白組結(jié)腸黏膜上皮完整，連接緊密，腸腺排列規(guī)整，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組可見黏膜層破壞明顯，上皮細(xì)胞連接松散，杯狀細(xì)胞減少，隱窩變形且破壞，并見大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。艾灸組、美沙拉嗪組黏膜缺損情況較模型組輕，隱窩破壞較少，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 各組小鼠HE染色檢測(cè)結(jié)果（400倍）

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織TLR-4、NF-κB p65、TNF-α的免疫組化檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 TLR-4的免疫組化檢測(cè)結(jié)果 空白組結(jié)腸組織表達(dá)極少量，與空白組相比，模型組腸黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，TLR-4蛋白的表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），結(jié)果顯示有大量棕色顆粒彌漫于結(jié)腸組織黏膜各層的胞質(zhì)及胞膜中，染色較其他組深且密集。與模型組相比，艾灸組和美沙拉嗪組TLR-4蛋白的表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。見表2，圖2。

表2 各組小鼠免疫組化結(jié)果比較（平均光密度值，±s）

表2 各組小鼠免疫組化結(jié)果比較（平均光密度值，±s）

組 別n N F-κ B p 6 5 T L R-4 T N F-α空白組模型組美沙拉嗪組艾灸組6 6 6 6 0.2 6 0±0.0 5 2 0.5 5 1±0.0 8 0△0.3 4 8±0.0 2 3 0.3 4 3±0.0 1 4*0.1 8 3±0.0 1 8 0.5 8 8±0.0 1 7△0.3 8 5±0.0 2 9 0.2 7 8±0.0 2 3*0.1 6 3±0.0 0 5 0.5 4 2±0.0 8 7△0.3 6 2±0.0 2 8 0.2 9 3±0.0 3 9*

圖2 各組小鼠TLR-4免疫組化檢測(cè)結(jié)果（40倍）

2.4.2 NF-κB p65免疫組化檢測(cè)結(jié)果 空白組結(jié)腸組織表達(dá)極少量，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，與空白組相比，模型組腸黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），結(jié)果顯示有大量棕色顆粒彌漫于結(jié)腸組織黏膜各層的胞質(zhì)、胞核中，染色較其他組深且密集。與模型組相比，艾灸組與美沙拉嗪組NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。見表2，圖3。

圖3 各組小鼠NF-κB p65免疫組化檢測(cè)結(jié)果（40倍）

2.4.3 TNF-α免疫組化檢測(cè)結(jié)果 空白組結(jié)腸組織表達(dá)極少量，與空白組相比，模型組腸黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，TNF-α蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），主要表達(dá)于炎性細(xì)胞，染色較其他組深且密集。與模型組相比，艾灸組與美沙拉嗪組TNF-α蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），兩組無(wú)明顯差異（P＞0.01）。見表2，圖4。

圖4 各組小鼠TNF-α免疫組化檢測(cè)結(jié)果（40倍）

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB p65、TLR-4、TNF-α的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

與空白組相比，模型組小鼠NF-κB p65、TLR-4、TNF-α相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，艾灸組NF-κB p65、TLR-4、TNF-α相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。艾灸組與美沙拉嗪組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。見圖5～圖7。

圖5 各組小鼠TLR-4的相對(duì)表達(dá)量

圖6 各組小鼠T N F-α的相對(duì)表達(dá)量

圖7 各組小鼠NF-κB p6的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

UC作為消化道非特異性炎性疾病[11]，治愈難、治愈慢，易引發(fā)癌變，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病[12]。目前UC病因尚未明確，多認(rèn)為與免疫調(diào)節(jié)和應(yīng)答異常有關(guān)。其炎癥局限于腸道黏膜層，故腸道黏膜層免疫系統(tǒng)對(duì)UC防治十分重要[13-14]。TLR4∕NF-κB信號(hào)通路已被證實(shí)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[15]。TLRs是一種細(xì)胞表面跨膜信號(hào)傳導(dǎo)受體[16]，其中TLR4是具有信號(hào)傳導(dǎo)功能的天然免疫識(shí)別受體，與相關(guān)病原分子非特異性結(jié)合后，通過信號(hào)傳導(dǎo)激活TLR-4∕NF-κB通路[17]，NF-κB p65具有功能活性和多向性[18]，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能后可介導(dǎo)大量炎性分子釋放，其中TNF-α可誘導(dǎo)腸上皮表達(dá)TLR4，加重炎性反應(yīng)，阻礙腸黏膜系統(tǒng)恢復(fù)，甚至引發(fā)多種疾病[19-20]。由此認(rèn)為，TLR4可作為UC的重要檢測(cè)指標(biāo)，NF-κB p65活化表達(dá)異常亦是UC的病理學(xué)機(jī)制之一，故調(diào)節(jié)TLRs∕NF-κB∕TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)UC的治療極為重要。

UC屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“腸澼”“痢疾”等范疇，病位在腸，多由脾腎不足、外感六淫，七情所傷、飲食不節(jié)等所致，尤以濕邪為主要致病因素。艾灸療法將艾絨燃燒的溫?zé)岽碳ぷ饔糜隗w表腧穴，激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣調(diào)節(jié)臟腑平衡，對(duì)UC具有治療作用。神闕穴位于臍中為任脈要穴，內(nèi)含豐富血管，皮下緊鄰腸道，直對(duì)本病病位，具有培元固本、和胃理腸之功。如宋代王執(zhí)中在《針灸資生經(jīng)》中記載“神闕治泄利不止”“臍中主腸中常鳴”。研究表明[19-20]，艾灸治療UC療效確切，總有效率可達(dá)90%。本研究采用DSS灌胃的造模方法，基于TLRs∕NF-κB∕TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探討其起效機(jī)制。結(jié)果較之模型組，艾灸組顯著改善UC小鼠腹瀉、便血等癥狀，且糞便恢復(fù)情況較美沙拉嗪組快，第3天左右即變成軟便或成型。HE染色顯示艾灸組、美沙拉嗪組黏膜缺損情況較模型組輕，隱窩破壞較少，炎性細(xì)胞減少。免疫組化觀測(cè)經(jīng)艾灸處理后，TLR4、NF-κB p65和TNF-α的蛋白表達(dá)量明顯下降，且組織形態(tài)明顯恢復(fù)。從mRNA層面進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的結(jié)果與其他方法趨勢(shì)一致，說明艾灸有效治療UC可能與TLRs∕NF-κB∕TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

綜上所述，UC病因復(fù)雜，需進(jìn)一步探索研究，更深入了解其作用機(jī)制，制定出更科學(xué)的艾灸方法，如結(jié)合艾灸特性尋找其起效的關(guān)鍵點(diǎn)，如不同溫度對(duì)治療效果的影響等，將艾灸更合理地應(yīng)用在UC的治療上。