計算機輔助精子分析在大熊貓精子濃度測定的應(yīng)用

賴燕舞,楊 波,李曉燕,周 強,李 鳳,王 群, 唐 勇,唐 誠,謝術(shù)紅,周應(yīng)敏,羅 波,黃 炎

(中國大熊貓保護(hù)研究中心 大熊貓國家公園珍稀動物保護(hù)生物學(xué)國家林業(yè)和 草原局重點實驗室,四川 都江堰 611830)

精子濃度是精液質(zhì)量評估的一個重要指標(biāo)，也是指征男性生育能力的最佳標(biāo)志[1]。自1978年大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)人工授精技術(shù)首次在北京動物園應(yīng)用成功以來[2]，人工授精技術(shù)已逐漸完善并作為圈養(yǎng)大熊貓人工繁育的重要技術(shù)手段，以彌補自然交配的雄性大熊貓數(shù)量不足、促進(jìn)不能自然交配的雄性個體參與繁殖以及提高遺傳多樣性[3]，而人工授精的成功率與凍精的質(zhì)量存在重要的關(guān)聯(lián)性[4-6]。精液的精子濃度決定了凍精的稀釋比例，一般做1～7倍稀釋[7]。因此，精子濃度不僅是衡量雄性大熊貓生殖能力指標(biāo)，也是影響凍精質(zhì)量以及人工授精成功率的重要因素。

既往采用常規(guī)精液分析(Semen routine analysis,SRA)對精液質(zhì)量進(jìn)行評估，該方法是一種傳統(tǒng)的分析方法，簡單且認(rèn)可度高，但檢測時間較長，人為差異較大。20世紀(jì)80年代，計算機輔助精液分析(Computer aided semen analysis，CASA)已開始應(yīng)用，如今越來越多的運用到公畜繁殖力評估[8]。CASA通過對精子動態(tài)圖像進(jìn)行分析，并提供精子動力學(xué)的量化數(shù)據(jù)，檢測迅速、客觀、精確，已被廣泛應(yīng)用在人類臨床精液質(zhì)量的評估[9]。本試驗首次比較CASA與SRA兩種方法對大熊貓精子濃度檢測的結(jié)果是否具有差異性，以評估CASA在大熊貓精液質(zhì)量分析中的準(zhǔn)確性和應(yīng)用性。

1 材料與方法

1.1 計數(shù)工具 全自動精子分析儀(邁朗ML-500 JZ，南寧松景天倫生物科技有限公司)；邁朗CASA精子計數(shù)板(板池深度=20 μm)；血細(xì)胞計數(shù)板(XB-K-25，25×16型，上海)。

1.2 精液的采集 于2018—2019年間，利用直腸電刺激采集14只雄性大熊貓精液，年齡8～20歲，均為參與繁殖的雄性個體。共得到26例大熊貓新鮮精液樣本。

1.3 計數(shù)方法

1.3.1 全自動精子分析儀 進(jìn)行CASA時，將大熊貓新鮮精液用生理鹽水稀釋成1∶25、1∶50或1∶100，每個樣本制作2份稀釋液。混勻后取10 μl精液于CASA精子計數(shù)板池內(nèi)，放于顯微鏡載物臺上靜置1 min，在10×10倍鏡下檢測。每份稀釋樣本掃描5～20個視野，至少檢測500條精子。分別用自動和手動2種模式進(jìn)行檢測(自動模式：由計算機自動識別精子并進(jìn)行統(tǒng)計分析；手動模式：人為識別精子并進(jìn)行標(biāo)注，再由計算機進(jìn)行統(tǒng)計)。精子濃度=N1(平均每個視野下的精子個數(shù))×0.386×106×稀釋度(25或50或100)。

1.3.2 血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)方法 進(jìn)行SRA時，參考王亞民[10]使用血細(xì)胞計數(shù)板對精子進(jìn)行計數(shù)。將1∶25、1∶50或1∶100的稀釋精液再稀釋成1∶200，同樣制作2份稀釋液?；靹蚝蠹尤胫裂?xì)胞計數(shù)板中。對中央大方格進(jìn)行精子計數(shù)(整個計數(shù)區(qū))，精子濃度=N2(中央大方格精子個數(shù))×104×200。

1.4 統(tǒng)計分析 計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，隨之進(jìn)行配對樣本t檢驗，P<0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精液稀釋度對CASA、SRA檢測結(jié)果的影響 將1例精液進(jìn)行1∶5稀釋，再依次進(jìn)行等比稀釋，最終稀釋成1∶1 280精液，各制作2份。依次對1∶5、1∶10、 1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1 280倍共9個稀釋度精液進(jìn)行CASA和SRA分析。結(jié)果如圖1所示，隨著稀釋度的增加，CASA(自動模式)所得出的精子濃度也逐漸增大，整體的等比性較差，尤其表現(xiàn)在低稀釋度區(qū)間(1∶5、1∶10和1∶20)和高稀釋度區(qū)間(1∶320、1∶640和1∶1 280)。僅在1∶40、1∶80和1∶160稀釋度間呈現(xiàn)出較好等比性，所得精子濃度幾乎相同，分別為(2 509.0±32.8)×106/mL、(2 501.3±43.7)×106/mL和(2 593.9±87.3)×106/mL。CASA(手動模式)與SRA得出的結(jié)果呈現(xiàn)出波浪式波動，整體的等比性均較好。CASA(自動模式)與CASA(手動模式)在1∶40、1∶80、1∶160稀釋度間的重疊性較好，所得精子濃度基本相同。3種稀釋度下所對應(yīng)的平均每個視野下的精子個數(shù)分別為163/166、81/82、42/42(CASA自動模式/手動模式)。

圖1 精液等比稀釋后的CASA和SRA分析結(jié)果Fig.1 CASA and SRA analysis results under geometric dilution of semen

2.2 CASA與SRA比較 精子濃度在10億以下的SRA、CASA(自動模式)和CASA(手動模式)檢測結(jié)果分別為(847.7±302.1)×106/mL、(955.3±408.8)×106/mL和(915.7±350.6)×106/mL；在10億～20億精子濃度區(qū)間內(nèi)，檢測結(jié)果分別為(1 511.9 ±352.0)×106/mL、(1 582.9±393.5)×106/mL和(1 567.4±357.2)×106/mL；精子濃度在20億以上時，分別為(2 407.4±207.5)×106/mL、(2 840.5±561.9)×106/mL、(2 816±562.7)×106/mL。差異性分析顯示(圖2)，精子濃度在10億/mL以下，SRA與CASA(自動模式)和CASA(手動模式)的檢測結(jié)果均無顯著差異性(N<10=5；T<10=-0.916，-0.836；P<10=0.412，0.450)。精子濃度在10億～20億/mL范圍內(nèi)，同樣不存在顯著差異性(N10～20=12；T10～20=-1.265，-1.257；P10～20=0.232，0.235)。而精子濃度在20億/mL 以上時，SRA與CASA(自動模式)和CASA(手動模式)均存在顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(N>20=9；T>20=-2.819，-2.684；P>20=0.023，0.028<0.05)。在3個濃度區(qū)間內(nèi)的CASA(自動模式)與CASA(手動模式)均不存在顯著差異性(T<10=1.008，T10～20=0.628，T>20=0.787；P<10=0.370，P10～20=0.543，P>20=0.454)。

圖2 精子濃度在不同區(qū)間內(nèi)的結(jié)果比較Fig.2 Results comparison of sperm concentration in different intenval*:差異性顯著(P<0.05)*:Significant difference (P<0.05)

2.3 大熊貓精子濃度分布 本試驗統(tǒng)計了中國大熊貓保護(hù)研究中心2006—2020年間參與繁育的雄性大熊貓的精子濃度情況(圖3)，共計71例精液樣本(包含本試驗測定的26例)。精子濃度由SRA分析得出。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，大熊貓精子濃度為(1 715.2±1 134.2)×106/mL，且集中分布在5億～25億/mL(各濃度區(qū)間的百分比>10%)，占總體的78%以上。其中，10億～15億/mL 約占總體的3成。

圖3 大熊貓精子濃度分布情況Fig.3 Sperm concentration distribution of giant panda

表1 大熊貓精液稀釋度參考(CASA)Table 1 Dilution reference of semen in giant panda by CASA

3 討論

本試驗發(fā)現(xiàn)，利用CASA檢測精子濃度時，精液的稀釋度對檢測結(jié)果有直接影響。尤其是在自動模式下，當(dāng)稀釋度過低，每個鏡下視野中精子個數(shù)過多，精子很可能發(fā)生重疊，進(jìn)而影響對精子的識別，會導(dǎo)致結(jié)果偏低；稀釋度過高，鏡下精子數(shù)過少，計數(shù)誤差偏大(標(biāo)準(zhǔn)誤增大，圖1)。因此，針對于本試驗中的CASA系統(tǒng)，將每個視野下的精子個數(shù)控制在50～150個，CASA表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性。因此在實際操作中，可參考表1進(jìn)行精液稀釋。

當(dāng)大熊貓精子濃度在20億/mL以下時，2種方法檢測結(jié)果無顯著性差異；而當(dāng)精子濃度>20億/mL 時，CASA檢測結(jié)果顯著高于SRP?？赡苁谴笮茇埦褐泻械木奘杉?xì)胞和被吞噬的衰亡精子及其碎片[11]，還包含非精子細(xì)胞、細(xì)胞碎片或精液內(nèi)顆粒雜質(zhì)等(大小與精子頭部相仿)，會導(dǎo)致計算機誤將其分析為精子，最終測定的結(jié)果遠(yuǎn)大于實際精子濃度，這與高彩鳳等[9]得出的結(jié)論相似。CASA的自動與手動模式所得結(jié)果無差異表明，CASA對精子的識別性較好，可重復(fù)性好，而且在自動模式下可以對精子濃度進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測定。常規(guī)精液分析往往受到檢測者技術(shù)熟練程度和主觀因素的影響，分析時間較長且無法測定精子的微細(xì)運動情況。而CASA很好地克服了主觀因素，不僅能夠客觀、快速地測定精子濃度與活力等質(zhì)量參數(shù)，而且還能顯示單個精子的運動軌跡，提供精子動力學(xué)的量化數(shù)據(jù)，如直線/曲線速率、直線性、向前性、側(cè)擺幅度、鞭打頻率等，為精液質(zhì)量評估提供更多的客觀參考指標(biāo)[12-13]。因此，CASA在精液分析方面比傳統(tǒng)方法具有優(yōu)越性。但是，CASA仍然存在一定的局限性，不能完全取代人工計數(shù)法。CASA在檢查過程中易受到諸多因素的影響，包括圖像清晰度、精液顆粒雜質(zhì)情況、精子濃度、精液稀釋度、操作者熟練程度等，故CASA還需要進(jìn)一步優(yōu)化系統(tǒng)參數(shù)、熟練操作并同時結(jié)合常規(guī)分析方法，以確保檢測的精確性。

大熊貓精子濃度為(1 715.2±1 134.2)×106/mL，這與黃炎等[3,14-15]報道的結(jié)果相一致。相比其他動物而言，如非洲獅(Pantheraleo)的精子濃度為1.94×109/mL[16]、亞洲黑熊(Ursusthibetanus)為(13.90±8.19)×108/mL[17]、北極狐(Vulpeslagopus)為(1.95±1.07)×108/mL[18]、美洲豹(Pantheraonca)為(6.20±3.03)×106/mL[19]、云豹(Neofelisnebulosa)為2.7×106～8×106/mL[20]，大熊貓的精子濃度表現(xiàn)出很高的水平。而大熊貓精液中高水平的精子濃度，很可能是一種繁殖策略，以提高雌性個體的懷孕率，能夠產(chǎn)下后代。單從精子濃度上講，大熊貓可能擁有著不弱的生殖能力。

本試驗嘗試將CASA應(yīng)用到大熊貓精子濃度分析，且表現(xiàn)出較好的應(yīng)用性。同時，本試驗也為今后拓展大熊貓精液質(zhì)量分析和精液質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以及大熊貓精液質(zhì)量評估體系的建立打下基礎(chǔ)。