曹公譯, 李晨曦, 馬 蕾, 杜林娜, 王麗萍， 劉 艷

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院, 長春 130118; 2. 吉林大學 生命科學學院, 長春130012)

肉靈芝(meat-likeGanodermalucidum, MGL)， 又稱太歲[1]， 因其兼具原生生物和真菌的特點， 又不屬于動物、 植物和微生物等常見生物類群， 目前尚無統(tǒng)一的生物學分類， 因而被稱為“第四生命體”[1-2], 其富含吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)[3-4]， 具有安神助眠的功效， 對胃腸、 肝腎、 心腦等器質(zhì)性病變， 糖尿病、 高血壓等代謝性系統(tǒng)疾病， 以及腫瘤防治等均有較好的醫(yī)療效果[5-8]； 并有助于平衡機體氧化還原穩(wěn)態(tài)[9]、 抑制腫瘤[10]、 抗放射、 提高肝臟、 骨髓、 血液合成DNA、 RNA和蛋白質(zhì)能力[11]. 作為天然的營養(yǎng)補充劑， 肉靈芝及其浸提物的保健功效明顯， MGL比靈芝(GL)[12-16]組成更多樣， 功效更全面， 且具有很強的再生能力， 對其藥用成分進行研究與開發(fā)更具有價值. 但對其藥用價值和作用機制仍需進一步的探究和科學性的評價.

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans, 線蟲)作為典型的模式生物， 具有個體微小， 周身透明， 生命周期短， 生理現(xiàn)象明確、 易觀察， 遺傳背景清晰、 成本低、 易操作等優(yōu)點[17-18]， 廣泛應用于抗氧化、 抗衰老、 藥物篩選、 遺傳進化等領域的研究. 近年來， 以線蟲為模型對天然植物、 動物及微生物來源的提取物及其有效成分的藥效學和毒理學評價研究日益廣泛[19-23]； 以線蟲經(jīng)典的生理指標、 壓力誘導及轉(zhuǎn)基因模型等為參考的藥效學評價和作用機制探究也取得了重要進展[24-27]. 然而， 以線蟲為模型評價肉靈芝及其浸提物抗氧化作用功效及其機制的研究目前尚未見文獻報道.

本文以線蟲正常和壓力誘導條件下生理病理指標為參考， 結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學分析， 探究人工培育肉靈芝浸提物對壓力誘導條件下線蟲氧化損傷的保護作用及其潛在作用靶點， 為肉靈芝及其有效成分的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器、 材料與試劑

BT25S型電子分析天平(上海天平儀器廠)、 MLS-3750型高壓滅菌鍋(日本SANYO公司)、 GZX-9070 MBE型電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器廠)、 Centrifuge 5810R型高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)、 ALPHA 1-4 LD plus型凍干機(瑞士Buchi公司)用于實驗試劑配制和肉靈芝浸提物提取、 凍干； UV-2501PC型紫外可見光分光光度計(香港基因有限公司)用于肉靈芝浸提物質(zhì)控監(jiān)測； SPL-80型生化培養(yǎng)箱(上海精科儀器有限公司)、 SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州蘇凈集團泰安公司)、 XTL-24型體視顯微鏡(日本奧林巴斯公司)和手動移液器(北京大龍興創(chuàng)公司)等用于線蟲常規(guī)培養(yǎng)和實驗操作； Illumina高通量測序平臺(美國Illumina公司)用于線蟲轉(zhuǎn)錄組測序.

野生型秀麗隱桿線蟲(Bristol N2)和缺陷型大腸桿菌(EscherichiacoliOP50)均購自美國線蟲遺傳中心； 肉靈芝參照文獻[28]及其改良法經(jīng)標準規(guī)程人工培育， 肉靈芝浸提物經(jīng)凍干后備用[8]； 酵母提取物和胰蛋白胨購自英國OXOID公司； 瓊脂粉、 膽固醇及其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 方 法

1.2.1 肉靈芝浸提液制備

參照標準規(guī)程[28]用人工液體培育肉靈芝后， 采用離心的方式固液分離， 收集液體部分即為肉靈芝浸提物(MGL)， 其浸出液呈濃稠黃褐色透明狀， 成分及性狀穩(wěn)定， 液質(zhì)均勻， 其有效活性成分及含量見文獻[5-8]. 用培養(yǎng)至對數(shù)生長期的E.coliOP50(OD600=0.4～0.6)稀釋MGL凍干品至終質(zhì)量濃度為1.5，2.5，5.0 mg/mL， 相同質(zhì)量濃度E.coliOP50為空白對照組.

1.2.2 線蟲培養(yǎng)

采用固體培養(yǎng)法在線蟲生長(NGM)培養(yǎng)基表面涂布E.coliOP50菌液， 待E.coliOP50形成均質(zhì)菌膜后轉(zhuǎn)移線蟲至NGM培養(yǎng)基表面生長、 繁殖并完成整個生命周期， 培養(yǎng)條件維持20 ℃， 飽和濕度95%, 恒溫恒濕. 實驗選取蟲卵進行同期化培養(yǎng)(記為0 d)， 待線蟲成長至L4期進行給藥處理， 每天轉(zhuǎn)移線蟲至含有新鮮E.coliOP50菌膜的NGM培養(yǎng)基中， 并觀察線蟲的生長和運動狀態(tài)， 記錄存活、 丟失及死亡數(shù)量.

1.2.3 線蟲生理指標評估

線蟲存活率和產(chǎn)卵量是衡量線蟲生長狀態(tài)、 氧化損傷、 衰老及藥物毒性作用的經(jīng)典生理指標[29-30]. 存活率實驗選取L4期同期化線蟲50只/組進行不同質(zhì)量濃度MGL給藥處理， 采用觀察和觸碰法記錄線蟲的生長和生活狀態(tài)， 將輕微觸碰線蟲軀干無明顯應激反應且咽部無收縮變化視為死亡； 將爬壁干枯或泄殖腔堵塞出現(xiàn)蟲袋樣線蟲記為丟失， 予以剔除. 產(chǎn)卵實驗選取同期化產(chǎn)卵期成蟲5只/組， L4期預喂食不同劑量MGL處理， 每天轉(zhuǎn)移線蟲至新鮮培養(yǎng)基至產(chǎn)卵期結(jié)束， 恒溫恒濕培養(yǎng)蟲卵至孵化， 觀察并統(tǒng)計幼蟲數(shù)記為線蟲日產(chǎn)卵量[31].

1.2.4 線蟲氧化壓力模型構(gòu)建及氧化損傷評估

活性氧自由基(ROS)可參與并反映機體的生理生化變化及病理過程[32-34]. 熱刺激和毒物刺激是誘發(fā)機體氧自由基爆發(fā)及氧化-還原穩(wěn)態(tài)失衡的主要因素之一. 線蟲在35 ℃熱刺激和過氧化氫誘導慢性氧化損傷條件下將發(fā)生顯著的熱激應答反應和毒物刺激響應， 表現(xiàn)為存活率降低和體內(nèi)ROS驟增[35-36].

1) 熱激實驗. 選取L4期同期化線蟲30只/組， 持續(xù)喂食3 d不同劑量MGL后， 轉(zhuǎn)移線蟲至新鮮培養(yǎng)基中， 于35 ℃恒溫恒濕熱激誘導10 h， 期間每小時統(tǒng)計線蟲存活數(shù)量， 將觸碰無應激響應且咽部無收縮反應視為死亡.

2) 氧化損傷實驗. 選取L4期同期化線蟲30只/組， 20 ℃培養(yǎng)條件下持續(xù)3 d喂食不同劑量MGL后， 轉(zhuǎn)移線蟲至20 mmol/L過氧化氫培養(yǎng)基表面誘導慢性氧化損傷模型， 期間每30 min統(tǒng)計線蟲存活數(shù)量， 以觸碰和咽收縮反應判斷線蟲存活狀態(tài).

3) 氧化損傷評估. 采用2,7-二氯二氫熒光素二乙酯(H2DCFDA)染色法評價線蟲體內(nèi)氧自由基水平. 實驗選取L4期同期化線蟲100只/組， 持續(xù)喂食3 d不同劑量MGL后， 用M9 緩沖液沖洗并收集線蟲至離心管中， 離心棄緩沖液， 采用終濃度100 μmol/L H2DCFDA避光靜止染色線蟲2 h后， M9 緩沖液沖洗線蟲表面殘余染料， 轉(zhuǎn)移線蟲至瓊脂載玻片， 熒光顯微鏡(激發(fā)波長485 nm， 發(fā)射波長530 nm)觀察并拍照.

以上實驗均設置3個平行實驗重復.

1.2.5 線蟲轉(zhuǎn)錄組學分析

實驗遵循RNA-seq高通量測序分析標準化流程， 將對照組和MGL組線蟲收集， 經(jīng)RNA提取、 mRNA富集和反轉(zhuǎn)錄、 PCR富集和文庫質(zhì)控， 用Illumina平臺進行測序分析， 從整體水平反映喂食MGL后各組線蟲細胞中基因轉(zhuǎn)錄情況， 并探究MGL潛在作用靶點.

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

采用GraphPad Prism 5.01軟件進行數(shù)據(jù)分析； 用Kaplan-Meier方法繪制線蟲存活率曲線; 用Log-rank (Mantel-Cox) Test 進行顯著性檢驗分析，p<0.05*表示具有顯著性差異,p<0.01**表示極顯著差異； 基于BMKCloud(www.biocloud.net)云平臺進行轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 肉靈芝浸提物主要成分分析

文獻[5,7]采用BCA法、 定磷法、 苯酚-硫酸法、 顯色反應、 NBT-Gly法和比色法等對本批次肉靈芝浸提物進行成分分析， 結(jié)果表明, 肉靈芝浸提物含有蛋白質(zhì)、 核酸、 多糖、 維生素C、 維生素E、 吡咯喹啉醌(PQQ)及游離氨基酸等成分. 對浸提物進行紫外全波長掃描， 結(jié)果如圖1所示. 由圖1可見， 浸提物在227，280 nm處有特征吸收峰， 與醌類和蛋白質(zhì)的兩個特征吸收峰帶區(qū)相符， 核酸、 多糖和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)不在特征吸收峰帶區(qū)范圍內(nèi)， 因此肉靈芝浸提物的主要成分為醌類和蛋白質(zhì).

圖1 肉靈芝浸提物的紫外全波長掃描結(jié)果Fig.1 Ultraviolet full wavelength scanning results of MGL extracts

2.2 肉靈芝浸提物對線蟲壽命的影響

存活率是評價線蟲生理狀態(tài)及藥物毒性作用的重要參考指標. 圖2為肉靈芝浸提物對線蟲壽命的影響. 由圖2可見： 與對照組相比， 2.5 mg/mL的MGL可顯著延長線蟲壽命(p<0.01**)， 隨MGL喂食劑量的增加(5.0 mg/mL)， 對線蟲壽命的延長作用不明顯； 2.5 mg/mL的MGL可使半數(shù)線蟲存活23 d， 最長存活35 d， 相比對照組分別延長了43.75%和6.06%. 肉靈芝浸提物對線蟲產(chǎn)卵量的影響如圖3所示. 由圖3可見， MGL組與對照組線蟲的產(chǎn)卵量均呈先升高后降低的趨勢， MGL組日產(chǎn)卵量和總產(chǎn)卵量均高于對照組， 但無顯著性差異. 表明實驗條件下肉靈芝浸提物對線蟲的毒性作用較低， 且有一定程度的促排卵效果. 因此選擇最佳質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的MGL進行生理指標和抗氧化保護作用的評價研究.

2.3 肉靈芝浸提物對線蟲抵抗體外慢性氧化損傷的保護

為驗證肉靈芝浸提物對氧化壓力誘導條件下線蟲的保護作用， 分別構(gòu)建線蟲熱激壓力和過氧化氫誘導慢性氧化壓力損傷模型， 通過線蟲存活率的變化評估肉靈芝浸提物的保護作用, 結(jié)果如圖4所示. 由圖4(A)可見， 在35 ℃熱激誘導條件下， 預喂食2.5 mg/mL的MGL組較對照組存活率顯著增高； 在過氧化氫誘導慢性氧化損傷模型中(圖4(B))， 2.5 mg/mL肉靈芝浸提物可顯著延長線蟲的存活率.

圖4 肉靈芝浸提物對線蟲抵抗外界氧化壓力的影響Fig.4 Effect of MGL extracts on oxidative stress resistance of nematode

在此基礎上， 通過染色法定性和定量分析線蟲體內(nèi)氧自由基水平的變化， 結(jié)果分別如圖5和圖6 所示. 由圖6可見， 喂食2.5 mg/mL的MGL可顯著降低線蟲體內(nèi)ROS水平(p<0.01**)， 表明肉靈芝浸提物具有顯著的抗氧化功效， 可保護線蟲抵抗熱刺激和慢性氧化損傷， 降低線蟲體內(nèi)ROS水平， 發(fā)揮抗氧化保護作用.

圖5 2.5 mg/mL肉靈芝浸提物對線蟲ROS影響的熒光定量分析Fig.5 Fluorescence quantitative analysis of effect of 2.5 mg/mL MGL extracts on ROS of nematodes

圖6 2.5 mg/mL肉靈芝浸提物對線蟲ROS影響Fig.6 Effect of 2.5 mg/mL MGL extracts on ROS of nematodes

2.4 肉靈芝浸提物抗氧化作用機制

為進一步探究肉靈芝浸提物抗氧化的作用機制， 對MGL組和對照組線蟲進行轉(zhuǎn)錄組學的對比分析， 結(jié)果如圖7所示. 經(jīng)RNA-seq高通量篩選和基因庫凈化處理， 共獲得有效功能注釋基因15 569 個， 經(jīng)差異表達基因篩選(DESeq_EBSeq, FDR=0.001, FC=2)， 共獲得上調(diào)基因539個， 下調(diào)基因549個， 無顯著性差異變化基因14 481個(圖7(A))； 對其進一步GO富集分析， 篩選生物學過程、 分子功能和細胞組分分支中富集程度最高的前10個節(jié)點項， 內(nèi)含顯著性差異表達基因382個； 經(jīng)KEGG富集分析， 382個差異表達基因共富集到20個信號通路中(7(B))， 參與α-亞麻酸和脂肪酸代謝、 不飽和脂肪酸合成、 泛素調(diào)控蛋白水解和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與蛋白質(zhì)加工， 細胞間信號傳導和細胞動態(tài)平衡以及壽命調(diào)控信號通路基因均顯著性高表達. 選擇KEGG富集通路中顯著富集的9個通路內(nèi)含基因(21個)進行熱圖(圖7(C))、 蛋白互作(圖7(D))和功能注釋分析.

圖7 喂食肉靈芝浸提物線蟲的轉(zhuǎn)錄組學分析和潛在靶點挖掘Fig.7 Transcriptome analysis and potential target mining for nematodes fed with MGL extracts

其中基因ech-1.1 (Enoyl-CoA Hydratase)，acox-3/F08A8.4 (Acyl-coenzyme A oxidase)，fat-7 (Fatty-acid desaturase 7)參與調(diào)控不飽和脂肪酸生物合成、 碳和多種氨基酸的降解與代謝相關蛋白的表達；F44E5.4/F44E5.5和hsp-70基因與參與剪接體、 MAPK信號通路和內(nèi)吞作用相關蛋白的表達密切相關； Skp1蛋白家族(skr-5,7,8,9,10,12)和熱激蛋白HSP-70參與單肽介導的蛋白質(zhì)水解和加工； ?；o酶A氧化酶、 Skp1蛋白家族、 超氧化物歧化酶(sod-5)可發(fā)揮過氧化物酶活性， 調(diào)節(jié)線蟲體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的平衡. 喂食肉靈芝浸提物可顯著影響脂肪酸去飽和酶、 超氧化物歧化酶、 線粒體內(nèi)膜易位酶(timm-23)、 熱激蛋白家族、 金屬硫蛋白-1(mtl-1)和Skp1蛋白家族相關蛋白的表達， 依賴壽命調(diào)節(jié)信號通路發(fā)揮抗衰老和抗氧化的保護作用. 該結(jié)果進一步表明， 肉靈芝浸提物也具有潛在的調(diào)控脂肪代謝、 促進蛋白合成、 抗氧化和抗衰老的生理保護功效.

綜上所述， 本文以秀麗隱桿線蟲為模型， 通過線蟲存活率和產(chǎn)卵量生理指標、 氧化壓力誘導和轉(zhuǎn)錄組學方法分析， 綜合評價了肉靈芝浸提物的抗氧化作用效果. 結(jié)果表明， 肉靈芝浸提物的毒副作用低、 生物安全度高， 可抵抗熱刺激和氧化損傷誘發(fā)的機體氧化穩(wěn)態(tài)失衡， 從而發(fā)揮抗氧化的作用功效. 此外， 肉靈芝還具有潛在的減脂、 促進蛋白合成與抗衰老等保健作用， 為指導國民健康飲食、 抗氧化相關功能食品的開發(fā)提供了新思路.