徐 欣 劉中文 周其明 張永君 張耀亭 朱緒偉
(河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院,河南鄭州 450008)
柞蠶微孢子蟲引發(fā)柞蠶微粒子病,是重要的病害檢疫對象。蛋白質(zhì)組學(xué)是一個大規(guī)模、高通量地研究全套蛋白質(zhì)的學(xué)科,而質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為挖掘有價(jià)值的蛋白提供了一個更便捷的方法,成為重要的差異蛋白篩選技術(shù)。這一技術(shù)也被應(yīng)用在柞蠶微孢子蟲免疫反應(yīng)研究之中,研究者們基于其水平傳播過程始于柞蠶中腸[1],得到了柞蠶中腸的差異基因和差異蛋白[2],后續(xù)研究中也發(fā)現(xiàn)了感染后表達(dá)量顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因[3]。但是,關(guān)于柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶蛹的一些與免疫相關(guān)的蛋白種類與差異表達(dá)情況尚未見報(bào)道。柞蠶蛹是柞蠶羽化前的重要發(fā)育階段,蛹體內(nèi)劇烈地進(jìn)行著組織溶解和組織發(fā)生兩個過程,其中有可能還參與柞蠶微孢子蟲的垂直傳播過程。本試驗(yàn)運(yùn)用質(zhì)譜手段檢測柞蠶蛹侵染前后蛋白質(zhì)組成,并通過譜圖計(jì)數(shù)法比較不同樣品中的蛋白質(zhì)差異,以期篩選到在垂直傳播的關(guān)鍵時期與柞蠶免疫相關(guān)的蛋白,為蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。
供試材料為一化性柞蠶品種“豫大一號”的蠶蛹,由河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院柞蠶育種研究室提供。同一批柞蠶蛹,經(jīng)過鏡檢后取出柞蠶微孢子蟲感染蛹10個(雌雄各5個),正常蛹10個(雌雄各5個),將柞蠶蛹用無菌水清洗后,放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
每個柞蠶蛹剪取部分腹部組織,轉(zhuǎn)入2 mL離心管中,加兩顆5 mm磁珠,加適量有SDSL3、終濃度含EDTA的1×Cocktail,置于冰上5 min,加入終濃度10 mmol/L DTT;加入Tissue lyser后4 ℃下12 000 r/min離心15 min,取上清;加終濃度為10 mmol/L的DTT,56 ℃中水浴1 h;加入終濃度55 mmol/L的IAM,暗室放置45 min;加5倍體積預(yù)冷丙酮,-20 ℃放置2 h,4 ℃12 000 r/min離心15 min后棄上清;風(fēng)干沉淀,加入適量SDSL3,利用Tissue lyser 促進(jìn)蛋白溶解;4 ℃12 000 r/min離心15 min后取上清,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。此部分試?yàn)所用試劑購于Sigma公司。
制備12%分離膠和5%濃縮膠,加入含有β-巰基乙醇的上樣液,每孔10 μL上樣樣品。用考馬斯亮藍(lán)R250染色,再用脫色液(含30%甲醇,10%乙酸)脫色后采用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)照相。此部分試驗(yàn)所用試劑購于生工生物工程(上海)股份有限公司。
使用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜TripleTOF5600+LC/MS/MS系統(tǒng)(AB SCIEX公司)進(jìn)行分析,樣品通過微升流速的液相Eksigent microLC 415系統(tǒng)進(jìn)行分離。肽段樣品經(jīng)過上樣緩沖液溶解,由自動進(jìn)樣器吸入后結(jié)合至C18捕獲柱(5 μm,300 A,300μm×5mm),接著被洗脫至分析柱(3 μm, 120 A, 300μm×15mm)進(jìn)行分離。利用兩個流動相(流動相A:3% DMSO,0.1% formic acid,97% H2O;流動相B:3% DMSO,0.1% formic acid,97% ACN)建立分析梯度。液相的流速設(shè)置為5 μL/min。質(zhì)譜DDA模式分析時,每個掃描循環(huán)中包含一個MS全掃描(scan range 350-1 500 m/z,ion accumulation time 250 ms),以及隨后的40個MS/MS掃描(scan range 100-1 500 m/z,ion accumulation time 50 ms)。信號超過120 cps的肽段離子(+2~+5)觸發(fā)MS/MS掃描。MS/MS重復(fù)采集的排除時間設(shè)置為18 s。
TripleTOF5600+LC/MS/MS系統(tǒng)產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過ProteinPilot(V4.5)進(jìn)行檢索,采用的數(shù)據(jù)庫檢索算法是Paragon。檢索使用的數(shù)據(jù)庫是UniProt中Saturniidae的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫。檢索參數(shù)如下:Sample Type選Identification;Cys Alkylation選Iodoacetamide;Digestion選Trypsin;Search Effort設(shè)置為Rapid ID。檢索結(jié)果以Unused≥1.3為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,刪去反庫中檢索的條目和污染蛋白,余下的鑒定信息用作后續(xù)分析。
基于各蛋白譜圖數(shù),我們將篩選不同樣品中差異顯著的蛋白。綜合不同樣品中各蛋白定量差異及豐度,設(shè)置差異蛋白篩選邊界線y=c/(x-xo)。
運(yùn)用NCBI blastp程序,從nr庫中檢索與提交蛋白序列相似的蛋白,進(jìn)行功能注釋。再從GO或KEGG數(shù)據(jù)庫中得到提交蛋白序列對應(yīng)的GO term和KEGG通路信息。得到質(zhì)譜鑒定到的所有蛋白的注釋信息后,提取其中差異表達(dá)蛋白的相關(guān)信息,統(tǒng)計(jì)類別和數(shù)目,通過超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行功能富集分析,即可篩選出與該試驗(yàn)相關(guān)的顯著功能類別。
如圖1所示,二者均能分辨出多條清晰蛋白質(zhì)電泳帶,分子質(zhì)量 16~115 kD 范圍內(nèi),45 kD 附近均有高豐度表達(dá)蛋白。感染柞蠶微孢子蟲柞蠶蛹內(nèi)15 kD的蛋白質(zhì)比正常柞蠶蛹表達(dá)量高。
ZC-正常柞蠶蛹
統(tǒng)計(jì)所鑒定到肽段的質(zhì)量偏差。如圖2所示,橫坐標(biāo)表示各鑒定肽段質(zhì)量偏差,即質(zhì)譜檢測質(zhì)量與肽段理論質(zhì)量的偏差??v坐標(biāo)為肽段總數(shù)目。各肽段質(zhì)量偏差分布位于±20(ppm)之間,表明各肽段質(zhì)量偏差小于百萬分之二十,質(zhì)譜檢測精度良好。
圖2 肽段質(zhì)量偏差分布
試驗(yàn)中所用儀器檢測質(zhì)荷比范圍為350~1350 m/z,肽段離子化后大部分電荷數(shù)為2或3,結(jié)果符合質(zhì)譜檢測標(biāo)準(zhǔn)。
樣品經(jīng)質(zhì)譜檢測,根據(jù)圖3和表1所示的鑒定結(jié)果中部分蛋白信息來看,感染蛹和正常蛹的鑒定蛋白質(zhì)種類相近,鑒定出的蛋白質(zhì)種類分別為25個和106個,且感染蛹鑒定出的25種蛋白質(zhì)在正常蛹中均能對應(yīng)。但相應(yīng)肽段數(shù)量差別較大,可能與感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶蛹的氨基酸缺失(低酸血癥)[5]有關(guān),后期需要對篩選出的差異蛋白進(jìn)行功能鑒定,再結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步分析。
圖3 樣品概覽圖
表1 蛋白鑒定部分結(jié)果展示
計(jì)算不同樣品組間各蛋白譜圖數(shù)比值(ratio)和譜圖數(shù)平均值(MeanSP)。如圖4所示,以log2ratio為橫坐標(biāo),log2MeanSP為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖。設(shè)置差異蛋白篩選邊界線,根據(jù)各蛋白散點(diǎn)分布標(biāo)注差異顯著性。
圖4 差異表達(dá)蛋白篩選散點(diǎn)圖
根據(jù)log2ratio以及l(fā)og2MeanSP篩選各組樣品間差異蛋白并標(biāo)注差異顯著性。感染蛹和正常蛹的差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì)數(shù)量結(jié)果,篩選出顯著上調(diào)的蛋白1種,下調(diào)的蛋白3種,顯著下調(diào)的蛋白有37種,共篩選出41個差異蛋白,無差異蛋白67種。在篩選過程中,由于鑒定出的感染蛹蛋白質(zhì)種類較少,在進(jìn)行差異蛋白分析時,為了避免一些蛋白的表達(dá)量為0,無法處理的情況,采用在所有蛋白的表達(dá)量上加一個“背景表達(dá)量”,這個值設(shè)置為1,然后進(jìn)行l(wèi)og2(W/ZC)以及l(fā)og2MeanSP進(jìn)行篩選。部分差異表達(dá)蛋白結(jié)果見表2。
表2 部分差異表達(dá)蛋白列表
基因本體(Gene Ontology)是一個標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系,提供了一套動態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)化詞匯表,并以此從三個方面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性:參與的生物過程(BiologicalProcess),分子功能(Molecular Function)和細(xì)胞組分(Cellular Component)。
對所篩選出來的41個差異蛋白進(jìn)行GO功能分析,聚類到最多的生物過程是:細(xì)胞過程(cellular process)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)、代謝過程(metabolic process)、多細(xì)胞生物過程(multicellular organismal process)、發(fā)展過程(developmental process),見圖5(A),所涉及的生物過程除了細(xì)胞基礎(chǔ)及代謝功能外,參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)種類較多,這部分蛋白與柞蠶蛹免疫柞蠶微孢子蟲的反應(yīng)關(guān)系密切。所處的細(xì)胞組分的聚類分析中包含以下4個:細(xì)胞解剖實(shí)體(cellular anatomical entity)、細(xì)胞內(nèi)(intracellular)、細(xì)胞(cell)、含蛋白質(zhì)復(fù)合物(protein-containing complex),見圖5(B),其中細(xì)胞解剖部分最多,占到42.37%。同時富集的分子功能中結(jié)合功能(binding)、催化活性(catalytic activity)、結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)、抗氧化活性(antioxidant activity)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)這幾個方面的數(shù)量最多,見圖5(C),這與柞蠶蛹在侵染后應(yīng)激反應(yīng)的一些酶類活性變化有關(guān)。
(A)
在對這些差異蛋白進(jìn)行KEGG分析后顯示,軍團(tuán)菌病(Legionellosis)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmicreticulum)、甲型流感(Influenza A)、雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)幾條通路與柞蠶蛹免疫柞蠶微孢子蟲相關(guān),見圖6。圖6中Bar后的數(shù)字表示富集分析的P值,該圖展示KEGG富集結(jié)果的前15個條目。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工的KEGG信號通路圖如圖7所示,發(fā)現(xiàn)下調(diào)的蛋白有5個:蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3(ERp57)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP94)、熱休克蛋白(Hsp70、Hsp90)、晶狀體蛋白(sHSF)。
圖6 KEGG注釋和富集分析
圖7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工的KEGG通路圖
柞蠶微孢子蟲的傳播途徑有兩種[6],經(jīng)口傳染和胚種傳染。經(jīng)口傳染即水平傳播,有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)柞蠶中腸是柞蠶微孢子蟲水平傳播侵染的第 1 個組織也是重要組織[7],在侵染后中腸相關(guān)酶活性下降,起到免疫作用[8],還發(fā)現(xiàn)了幼蟲和蛹氨基酸缺乏癥[9]。本研究在建立柞蠶蛹侵染柞蠶微孢子蟲后的蛋白文庫時發(fā)現(xiàn),侵染組的蛋白質(zhì)種類總量較正常組有較大降低,這一點(diǎn)符合前人研究結(jié)果,同時顯著下調(diào)的蛋白也已經(jīng)篩選出來37種,為下一步分析蛋白功能提供方向。
41個差異蛋白的GO功能分析中,發(fā)現(xiàn)聚類到最多的生物過程是細(xì)胞過程、應(yīng)激反應(yīng)、代謝過程;分子功能中結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性這3個方面的數(shù)量最多。所處的細(xì)胞組分的聚類分析中包含細(xì)胞解剖實(shí)體、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞、含蛋白質(zhì)復(fù)合物,其中細(xì)胞解剖部分最多。這些蛋白與柞蠶蛹在侵染后應(yīng)激反應(yīng)的一些酶類活性變化有關(guān),參與免疫微粒子病的相關(guān)反應(yīng)。同時KEGG 通路富集分析結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路中的EPR57、GRP94、Hsp70、Hsp90、sHSF這5種蛋白下調(diào),初步預(yù)測為免疫蛋白,后期將進(jìn)行功能鑒定。