李玉娟， 肖楠， 劉珊， 劉菲菲， 隋巖

(1. 北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081；2．內(nèi)蒙古天奇生物科技有限公司，內(nèi)蒙古,赤峰市 024000)

鈣是人體所需的常量元素之一，能維持機(jī)體細(xì)胞正常功能. 人體99%的鈣元素以羥基磷灰石的形式存在于骨骼和牙齒中，其余游離鈣存在于血液、軟組織和細(xì)胞外液，形成混溶鈣池，骨骼中的鈣和混溶鈣池保持動態(tài)平衡[1]. 人體長期鈣含量攝入不足則會打破這個(gè)動態(tài)平衡，導(dǎo)致骨鈣儲留不足，引起骨質(zhì)疏松、佝僂癥等代謝性骨病的發(fā)生[2-3]. 根據(jù)中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的WS/T578.2—2018《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》，青少年每日鈣推薦攝入量為1 000～1 200 mg，成年人為800～1 000 mg. 但2019年中國居民營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查報(bào)告顯示，我國居民的膳食營養(yǎng)素中平均鈣攝入量不足營養(yǎng)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的50%，缺鈣現(xiàn)象在兒童、孕婦及老人等人群中則更為明顯[4]. 合理選擇補(bǔ)鈣制劑對改善我國居民鈣攝入量不足有重大意義.

目前，上市的補(bǔ)鈣制劑種類較多，主要包括無機(jī)酸鈣(如碳酸鈣、磷酸氫鈣等)、有機(jī)酸鈣(葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣、氨基酸螯合鈣、L-蘇糖酸鈣)等. 雖然碳酸鈣片劑目前市場占有率比較高，但其小腸吸收率僅有30%；葡萄糖酸鈣和乳酸鈣比碳酸鈣溶解性更好，但其含鈣量相對較低；L-蘇糖酸鈣的吸收率很高但價(jià)格昂貴[5]. 針對目前補(bǔ)鈣產(chǎn)品的現(xiàn)狀，亟待研發(fā)新型的補(bǔ)鈣制劑. 酶解骨粉(enzymatic hydrolyzed bone powder, EBP)是對牛骨物理處理后，采用酶水解法得到的產(chǎn)品，其具有鈣含量高、鈣易吸收的優(yōu)勢[6-7]，但目前全面評價(jià)酶解骨粉的相關(guān)研究較為少見. 本研究采用低鈣飼料喂養(yǎng)構(gòu)建低鈣大鼠模型，灌胃給予大鼠酶解骨粉，通過檢測股骨組織病理學(xué)、骨密度、股骨干重與灰重、骨鈣與骨磷含量、生物力學(xué)指標(biāo)、鈣表觀吸收率等，以期全面評價(jià)酶解骨粉的補(bǔ)鈣功效，為其臨床應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器和試劑

RM2235石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；DPX骨密度儀(美國LUNAR公司)；1195電子拉伸機(jī)(英國Instron公司)；Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；Centrifuge 5424高速臺式離心機(jī)(美國Eppendorf公司)；BP61電子分析天平(德國Sartorius公司)；DHP-9052A電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京陸?？萍加邢薰?；902型-80 ℃低溫冰箱(美國Thermo公司)；7500ce電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Bedford公司).

酶解骨粉(含鈣量為25%，內(nèi)蒙古天奇生物科技有限公司，批號20191212，保質(zhì)期三年)；碳酸鈣(優(yōu)級純，含鈣量為40%，石家莊西默科技有限公司，批號20191017，保質(zhì)期兩年)；水合氯醛(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號J22J10H90920，保質(zhì)期兩年).

低鈣飼料配制(含鈣量10～20 mg/kg，北京互持生物科技有限公司，批號20191209，保質(zhì)期三個(gè)月)[8]：酪蛋白10.0%，黃豆粉15.0%，小麥面粉54.0%，玉米油4.0%，纖維素2.0%，混合鹽2.6%，混合維生素 1.0%，氯化膽堿0.2%，dl-蛋氨酸0.2%, 淀粉11.0%.

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

4周齡雄性SD大鼠60只，SPF級，體重(80±10)g，由中國食品藥品檢定研究院提供，經(jīng)動物倫理委員會同意，許可證號：SCXK(京)2017-0005. 屏障環(huán)境飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(24 ± 2)℃，相對濕度40%～60%，12 h光/12 h暗交替. 自由采食和飲水. 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，期間自由攝食飲水.

1.3 構(gòu)建低鈣模型與給藥

4周齡健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組(CON)、低鈣模型組(MOD)、酶解骨粉低、中、高劑量組(分別記做LEBP、MEBP、HEBP)和陽性藥碳酸鈣(POS)組，每組10只. 對照組飼以正常飼料，自由飲水，其余各組大鼠給予低鈣飼料6周，自由飲用去離子水. 第7周開始，連續(xù)4周給與各組大鼠200、400、800 mg/kg的酶解骨粉混懸液、500 mg/kg的碳酸鈣混懸液，低鈣模型組和對照組大鼠灌胃給與等量去離子水.

1.4 鈣代謝實(shí)驗(yàn)

灌胃給藥最后3天進(jìn)行鈣代謝實(shí)驗(yàn). 將大鼠移入代謝籠，分籠喂養(yǎng). 記錄3天進(jìn)食量，連續(xù)收集72 h糞便，80 ℃烘干，稱重，記錄糞便量. 將鼠糞研細(xì)、過篩、混勻、消化，采用火焰原子吸收法測定糞鈣含量，計(jì)算鈣的表觀吸收率，計(jì)算公式如下：

攝入鈣=飼料中鈣含量×飼料消耗量

糞鈣=鼠糞中鈣含量×糞便量

鈣的表觀吸收率=(攝入鈣-糞鈣)/攝入鈣×100%

1.5 樣本收集

末次給受試物后禁食24 h，大鼠腹腔注射水合氯醛(0.3 g/kg)，待其麻醉后，剪開大鼠腿部皮膚，將大鼠左右兩側(cè)股骨剝離干凈，剔除脛骨上附著的肌肉組織和韌帶. 左側(cè)股骨用生理鹽水浸濕的紗布包裹，-80 ℃凍存；右側(cè)股骨固定于4%多聚甲醛中，4 ℃保存.

1.6 病理學(xué)檢查

將固定于組織固定液中的大鼠右側(cè)股骨用磷酸鹽緩沖液漂洗，置于4.13%的EDTA-2Na溶液(pH 7.4)中4 ℃脫鈣30天. 脫鈣完全后，以流水沖洗30 min，然后將右側(cè)后肢股骨上1/3端沿正中矢狀面剖開，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察.

1.7 骨密度、生物力學(xué)指標(biāo)檢測

取大鼠左側(cè)股骨置于DPX骨密度儀測試臺上，掃描并測定股骨中點(diǎn)密度. 在1195電子拉伸機(jī)上進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn). 將左側(cè)股骨放置于支座上，使其橫截面短軸方向與載荷方向保持一致，跨距為17 mm，加載速度為3 mm/min. 通過所得載荷-撓度曲線得到位移、斜率、強(qiáng)度力學(xué)指標(biāo).

1.8 股骨干重、灰重、骨鈣、骨磷含量測定

去除左側(cè)股骨軟組織，用生理鹽水沖去骨髓，在環(huán)流熱空氣高熱箱中120 ℃烘干1 h，用三氯甲烷和甲醇(2∶1)混合液浸泡72 h脫脂，烤箱120 ℃烘干6 h，稱量其干重. 然后置于馬福爐中600 ℃灰化6 h，測量其灰重. 采用火焰原子吸收法測定骨鈣、骨磷含量.

2 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析. 數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析，p< 0.05表示有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

3 結(jié)果與討論

3.1 酶解骨粉有效改善股骨組織病理學(xué)

采用HE染色對各組大鼠右側(cè)股骨進(jìn)行組織病理學(xué)觀察和病理評分，結(jié)果如圖1所示. 與對照組相比，模型組骨皮質(zhì)厚度降低，骨基質(zhì)黏液變性加重，骨小梁數(shù)量顯著減少且局部結(jié)構(gòu)紊亂，骨髓腔明顯擴(kuò)大，骨膜增生嚴(yán)重，表明長期低鈣飼養(yǎng)使模型組大鼠骨密度降低，骨脆性增加. 給與酶解骨粉后大鼠股骨中骨皮質(zhì)厚度提高，骨小梁數(shù)量顯著增加，骨髓腔面積減小，其中高劑量酶解骨粉和陽性藥組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)最為清晰(圖1(e),1(f))，表明酶解骨粉對低鈣導(dǎo)致的骨小梁減少和結(jié)構(gòu)紊亂有很好的保護(hù)作用.

3.2 酶解骨粉提高低鈣大鼠的鈣表觀吸收率

通過鈣代謝實(shí)驗(yàn)計(jì)算各組大鼠的鈣表觀吸收率，結(jié)果見表1. 模型組大鼠鈣表觀吸收率為-96.5%，與對照組相比顯著降低(p< 0.01)，說明鈣流失嚴(yán)重. 給予低鈣大鼠酶解骨粉后，低、中、高劑量組的鈣表觀吸收率依次為-2.55%、-1.57%和-0.283%，顯示大鼠體內(nèi)鈣表觀吸收率均顯著增加(與模型組相比，p< 0.01)，且隨著劑量的增加而提高. 以上結(jié)果說明酶解骨粉能有效緩解低鈣大鼠的骨鈣流失，有助于低鈣大鼠的鈣表觀吸收率恢復(fù)到正常水平.

表1 大鼠鈣表觀吸收率

3.3 酶解骨粉對低鈣大鼠股骨密度、生物力學(xué)指標(biāo)的影響

通過骨密度儀和三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)檢測大鼠股骨密度及生物力學(xué)指標(biāo)(位移、斜率、強(qiáng)度)，測定結(jié)果如表2所示. 相較于對照組，模型組大鼠股骨密度降低了17.8%. 與模型組相比，低、中、高劑量酶解骨粉組大鼠的股骨密度逐漸升高，高劑量組和陽性藥組大鼠股骨密度分別提高了14.1%和15.1%. 位移、斜率和強(qiáng)度都是衡量骨骼強(qiáng)度的重要力學(xué)指標(biāo)，可以反映骨生長代謝狀況. 模型組大鼠股骨位移和斜率均低于對照組大鼠，但未見顯著差異. 給予低鈣大鼠各劑量酶解骨粉后，大鼠股骨位移和斜率都表現(xiàn)出升高趨勢，而股骨強(qiáng)度表現(xiàn)無顯著規(guī)律. 以上結(jié)果表明，高劑量酶解骨粉能有效提升低鈣大鼠的股骨密度，并且對股骨力學(xué)性能的提高或有積極作用.

表2 酶解骨粉對低鈣大鼠股骨骨密度和生物力學(xué)指標(biāo)的影響

3.4 酶解骨粉對低鈣大鼠股骨干重、灰重、骨鈣和骨磷含量的影響

大鼠股骨干重(dry weight of femur)、灰重(ash weight of femur)、骨鈣(Ca-bone)和骨磷(P-bone)的測定結(jié)果如圖2所示. 與對照組相比，模型組大鼠股骨干重、灰重均顯著降低(p< 0.01)，分別減少了13.7%、15.1%. 酶解骨粉給藥大鼠的股骨干重、灰重隨著給藥劑量的增加而上升，干灰重比也略有提高，但與模型組相比未見顯著性差異. 與對照組相比，模型組大鼠股骨的骨鈣、骨磷分別降低了16.4%、16.9%. 三個(gè)劑量組的酶解骨粉均能顯著提高低鈣大鼠的骨鈣和骨磷含量(與模型組相比，p< 0.01). 低劑量酶解骨粉組升高大鼠股的骨鈣和骨磷含量效果最為顯著(與模型組相比，p<0.01)，分別提高了13.0%和15.0%，且效果顯著優(yōu)于陽性藥碳酸鈣. 以上結(jié)果說明酶解骨粉能有效提高低鈣大鼠骨骼中鈣磷酸鹽等礦物質(zhì)含量，促進(jìn)骨基質(zhì)中的鈣沉積，加快骨形成，從而發(fā)揮補(bǔ)鈣作用. 酶解骨粉對低鈣大鼠股骨鈣與磷含量的提升作用并未表現(xiàn)出劑量依賴性關(guān)系，低劑量酶解骨粉的作用最為顯著，或更能有效提高股骨中鈣磷酸鹽的含量.

圖2 各組大鼠股骨干重、灰重、骨鈣和骨磷含量

4 結(jié)束語

鈣主要經(jīng)小腸吸收，通過糞便和尿液排出，極少量通過皮膚經(jīng)汗液排出[9]. 人體的鈣吸收率一般為30%～80%[10]. 鈣代謝平衡實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的營養(yǎng)學(xué)研究方法[11]，鈣表觀吸收率表示了鈣元素在體內(nèi)吸收利用情況，鈣表觀吸收率高表示攝入的鈣在體內(nèi)的吸收效果好，其易受性別、鼠齡、環(huán)境、飼料成分等影響. 本研究除對照組大鼠之外，其余組均給予相同的低鈣飼料，含鈣量為10～20 mg/kg(維持飼料含鈣量為10～18 g/kg). 有研究表明鈣的攝入量會影響鈣表觀吸收率[12]，鈣攝入過少會導(dǎo)致“鈣饑餓”，導(dǎo)致機(jī)體最大化吸收利用鈣，使鈣表觀吸收率顯著增加，鈣攝入過多則會降低鈣吸收. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，低鈣飼養(yǎng)導(dǎo)致大鼠鈣流失嚴(yán)重，酶解骨粉能顯著提高低鈣大鼠的鈣表觀吸收率. 相對于模型組，低劑量酶解骨粉組大鼠的鈣表觀吸收率有顯著的提高，鈣流失大大減少，隨著酶解骨粉給藥劑量的提高，大鼠的鈣表觀吸收率上升幅度則明顯減緩.

缺鈣會導(dǎo)致骨密度和骨強(qiáng)度下降，嚴(yán)重會引起骨質(zhì)疏松和佝僂癥. 骨密度是骨骼強(qiáng)度的一個(gè)重要指標(biāo)，是衡量骨質(zhì)疏松程度的標(biāo)準(zhǔn)之一[13]. 良好的補(bǔ)鈣劑能有效提高骨密度. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酶解骨粉能有效提高低鈣大鼠的骨密度，降低骨髓腔部分面積，恢復(fù)骨小梁致密結(jié)構(gòu). 高劑量酶解骨粉組大鼠股骨密度顯著增加，與碳酸鈣給藥大鼠股骨密度水平相當(dāng). 骨骼中礦物質(zhì)的含量是決定骨密度的因素之一，鈣磷以羥磷灰鈣的形式構(gòu)成骨鹽，其比值大約為2∶1，并處于穩(wěn)定狀態(tài)[14]. 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著酶解骨粉劑量的增加，大鼠的股骨干重和灰重有增加趨勢，中劑量酶解骨粉組大鼠股骨的干灰重比的提高最為顯著. 各酶解骨粉組大鼠股骨中鈣、磷含量均顯著升高. 骨干灰重比、骨鈣和骨磷含量越高，均說明了酶解骨粉有良好的補(bǔ)鈣效果.

酶解骨粉以新鮮牛骨為原料，利用酶水解法促進(jìn)骨骼中鈣的轉(zhuǎn)化，使骨鈣充分分離出來，含有天然生物鈣、骨膠原蛋白，骨粉中鈣磷比適宜(約為2∶1). 酶解骨粉中的骨鈣與人體內(nèi)游離氨基酸作用生成可溶性氨基酸鈣，有助于鈣的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收. 骨膠原蛋白和鈣離子形成螯合物，能進(jìn)一步促進(jìn)鈣的利用. 此外，牛骨組成與人體骨組織相似，和人體骨細(xì)胞有較強(qiáng)的親和力，或許也是酶解骨粉生物利用率較高的原因之一，但其補(bǔ)鈣機(jī)制仍需進(jìn)一步研究.