張惠惠，李余良，劉建華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】近20 年來，甜糯玉米在我國華南地區(qū)發(fā)展快速。opaque2（o2）基因突變影響玉米籽粒胚乳中蛋白體形成、淀粉含量及氨基酸組成，其中，賴氨酸含量提高可使?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)大幅度提升［1］。因此，利用o2突變基因提高甜糯玉米籽粒的賴氨酸含量，對于提高和改良甜糯玉米營養(yǎng)價(jià)值具有重要意義［2］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1960 年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)o2突變玉米中賴氨酸和色氨酸含量大幅提高。Mertz 等證實(shí)o2突變玉米胚乳的賴氨酸含量比普通玉米提高69%［3］。研究認(rèn)為，o2突變導(dǎo)致玉米轉(zhuǎn)錄功能受到抑制，使醇溶蛋白合成減少，非醇溶蛋白含量相應(yīng)增加，從而使玉米籽粒的賴氨酸含量增加［4-6］。近年來，育種家通過不斷積累修飾因子，成功培育出優(yōu)質(zhì)蛋白玉米，主要是利用o2和基因協(xié)同作用提高玉米賴氨酸含量，籽粒胚乳呈現(xiàn)透明硬質(zhì)狀態(tài)［7］。目前將o2基因?qū)肱从衩椎难芯勘砻鳎蚜Ｙ嚢彼岷繒胁煌潭鹊奶岣撸?-9］。但關(guān)于胚乳修飾的機(jī)制仍未被充分挖掘，o2基因在不同基因型背景下調(diào)控籽粒賴氨酸的積累研究還不多見。【本研究切入點(diǎn)】甜玉米是由于o2基因突變所致，而糯玉米因Waxy基因突變所致，糯玉米缺乏賴氨酸等人體必需氨基酸，因此營養(yǎng)價(jià)值受到極大限制［10］。優(yōu)質(zhì)蛋白鮮食玉米分子標(biāo)記輔助育種過程中，o2突變體材料是最常用的高賴氨酸玉米供體［11］。近20 年來華南地區(qū)甜玉米產(chǎn)業(yè)進(jìn)入高速發(fā)展階段，作為特色優(yōu)勢作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和效益農(nóng)業(yè)中發(fā)揮重要作用。通過分子標(biāo)記輔助選擇把含o2突變基因的高賴氨酸玉米轉(zhuǎn)育甜玉米或糯玉米自交系，可創(chuàng)制高賴氨酸玉米材料，不僅能提高玉米的營養(yǎng)價(jià)值，而且能獲得優(yōu)質(zhì)蛋白甜玉米種質(zhì)資源，目前相關(guān)研究未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以含o2突變基因的高賴氨酸玉米轉(zhuǎn)育9 個(gè)甜玉米和1 個(gè)糯玉米自交系，以期后續(xù)研究利用后代籽粒表現(xiàn)及分子標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建甜/糯玉米o(hù)2近等基因系，為開展甜/糯玉米高賴氨酸育種研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

優(yōu)質(zhì)蛋白玉米HP3（o2/o2wx/wx）作為o2基因的供體親本，來源于普通玉米自交系5026，屬于黃改系類型，由陜西楊凌智種農(nóng)作物科學(xué)研究所張學(xué)信老師惠贈。9 個(gè)甜玉米受體材料分別為F1、F3、F4、F5、F7、F8、F9、F10、F11，基因型均為O2/O2sh2/sh2；F1、F4、F5、F7 為黃色優(yōu)質(zhì)甜玉米自交系，F(xiàn)3、F8、F9、F10、F11 為白色優(yōu)質(zhì)甜玉米自交系。1 個(gè)糯玉米受體材料為N13-1，基因型為O2/O2wx/wx，為白色糯玉米自交系。以上材料品質(zhì)優(yōu)良、農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間種植 2020—2021 年在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地開展種植。供體材料種植2 行，受體材料及雜交回交、自交后代材料種植1～2 行，行長4 m，株距32 cm，行距60 cm。

1.2.2 甜/糯玉米o(hù)2近等基因系創(chuàng)制流程 以HP3 作為o2基因的供體親本，與10 個(gè)甜/糯玉米自交系雜交，以受體材料作為輪回親本回交或F1雜交種進(jìn)行自交，根據(jù)籽粒表型及透射光觀察籽粒透明程度進(jìn)行子代初步篩選，然后利用SSR標(biāo)記對回交或自交后代單株進(jìn)行鑒定篩選。選擇基因型為o2/_sh2/sh2或o2/_wx/wx且表型與受體親本相似的雜合植株再進(jìn)行回交或自交，最后自交多代選擇o2基因純合且穩(wěn)定遺傳的植株，直至成功創(chuàng)制o2/o2-NILs 甜玉米或糯玉米（圖1）。

圖1 甜/糯玉米o(hù)2 近等基因系創(chuàng)制流程Fig.1 Construction process of o2-NILs in sweet/waxy maize

1.2.3 玉米籽粒表型觀察 觀察玉米籽粒的飽滿情況和色澤，并通過透射光觀察籽粒透明程度。

1.2.4 SSR 標(biāo)記檢測 當(dāng)植株生長到6～7 片葉時(shí)進(jìn)行單株掛牌，取約0.5 g 幼嫩的葉片裝入2.0 mL離心管，放入液氮冷凍后用研磨機(jī)將樣品打磨成粉末狀，采用改良CTAB 法［12］提取葉片基因組DNA，用滅菌ddH2O 將DNA 沉淀溶解，并稀釋到90 ng/μL 左右。SSR 引物序列來自MaizeGDB，由擎科（廣州）生物科技有限公司合成（表1）。PCR 體系15 μL，含2.4 μL 引物（20 μmol/L）、2.0μL DNA 模板、5.3 μL Taq PCR Master Mix（購自北京天根生化科技有限公司）和5.3 μL ddH2O。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用5×TBE 定容至800 mL，然后加200 mL 30%Acr Bis 定容至1 L 制成丙烯酰胺溶液，玻璃板制膠，插梳子靜止1 h，待膠變干拔出梳子，放置在電泳槽，點(diǎn)樣，電泳2 h，最后經(jīng)染色得到清晰條帶。

表1 引物名稱和序列Table 1 Primer names and sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型玉米籽粒外觀表型變化

從籽粒外觀來看，供體親本HP3（o2/o2 wx/wx）籽粒不透明，背面有凹陷，存在一定程度的皺縮，甜玉米籽粒明顯干癟皺縮，而N13-1 籽粒飽滿有光澤，所有輪回親本籽粒透光性好。當(dāng)轉(zhuǎn)入o2基因后，在雜交一代玉米穗上出現(xiàn)硬質(zhì)、甜質(zhì)不同類型的籽粒分離狀態(tài)，即不同基因型背景下的突變體籽粒表型不一致，回交一代籽粒表現(xiàn)為不同程度的皺縮，表面凹陷。從圖2 可以看出，大多數(shù)材料在o2基因突變后，籽粒飽滿程度和胚乳透光度均不同程度降低，但也存在O2基因突變籽粒表型不明顯的現(xiàn)象。整體來看，各組回交后代籽粒變小，呈現(xiàn)不同程度的不透光狀態(tài)。

圖2 親本玉米及后代籽粒透光性情況Fig.2 Light transmittance performance of grains of parental maize and its offspring

2.2 供體與受體親本多態(tài)性檢測

檢測供體和受體親本材料間的多態(tài)性是創(chuàng)制近等基因系首要的工作，本研究利用SSR 標(biāo)記phi057、phi112 和 umc1066 檢測受體甜/糯玉米自交系和供體HP3-o2/o2多態(tài)性，建立了分子標(biāo)記篩選各組子代基因型的方法。從圖3 可以看出，標(biāo)記phi057 能擴(kuò)增出3 種片段大小不同的特異性條帶，供體HP3 和各受體材料的多態(tài)性譜帶不同，各受體材料之間也存在多態(tài)性，標(biāo)記phi057在材料間多態(tài)性好，能夠?qū)λ鼈冞M(jìn)行鑒別，適合用于篩選3 種不同基因型的植株；而phi112 在供體HP3 的帶型與受體材料F3、F8、F9 相同，與其他材料帶型不同，不適合作為供體與所有受體材料鑒定的標(biāo)記；從umc1066 標(biāo)記分析結(jié)果看出，僅F4、F7、N13-1 帶型不同于供體HP3，其他材料與供體條帶相同，均不能區(qū)分供體和受體親本材料。因此，可以選擇phi057 標(biāo)記對下一步回交或自交后代o2基因進(jìn)行追蹤和鑒定。

圖3 SSR 標(biāo)記檢測玉米o(hù)2 供體自交系和受體自交系多態(tài)性Fig.3 Polymorphism of o2 donor and receptors inbred lines of maize detected by SSR markers

2.3 回交1 代群體的單株SSR 標(biāo)記檢測

將供體材料HP3 授粉予10 個(gè)受體材料形成各雜交組合，以各受體作為輪回親本進(jìn)行回交，利用SSR 標(biāo)記phi057 檢測回交群體中表現(xiàn)皺縮的甜玉米單株多態(tài)性。從圖4A 可知，在HP3 與F4雜交組合的回交后代BC1F1群體基因型中，編號1、5、6、7、12、13、14 等為雜合個(gè)體，基因型為O2/o2；編號2、3、4、8、9、10、11、15 等帶型與親本F4 一致，是純合顯性個(gè)體，基因型為O2/O2。同樣，從圖4B 可以看出，在HP3 與F5 雜交組合的回交后代BC1F1群體基因型中，編號1、2、3、4、6、8、10、13、15、16 等為雜合個(gè)體，基因型為O2/o2；編號5、7、9、11、12、14 等帶型與親本F5 一致，為純合顯性個(gè)體，基因型為O2/O2；在HP3 與F7 雜交組合的回交后代BC1F1群體基因型中，編號1、3、5、7、9、12、13、14、17、18 等為雜合個(gè)體，基因型為O2/o2；編號2、4、6、8、10、11、15、16 等帶型與親本F7 一致，為純合顯性個(gè)體，基因型為O2/O2。圖4C 顯示，在HP3 與N13-1 雜交組合的回交后代BC1F1群體基因型中，編號1、2、3、4、5、7、10、12、13、18、21、22、25、26、27、28 為雜合個(gè)體，基因型為O2/o2；編號6、8、9、11、14、15、16、17、19、20、23、24、29、30、31、32 帶型與親本F5 一致，為純合顯性個(gè)體，基因型為O2/O2。田間保留雜合個(gè)體繼續(xù)進(jìn)行回交篩選，去除顯性純合植株。其余6 組材料經(jīng)標(biāo)記篩選也獲得了一些雜合個(gè)體，表明o2基因已成功導(dǎo)入各受體材料，獲得了供體的隱性突變基因。

圖4 SSR 標(biāo)記phi057 檢測各BC1F1 群體的基因型結(jié)果Fig.4 Genotypes of BC1F1 population detected by SSR molecular marker phi057

2.4 自交群體的單株SSR 標(biāo)記檢測

對各雜交組合采用自交的方法，利用SSR 標(biāo)記phi057 檢測F2群體中表現(xiàn)皺縮的甜玉米單株多態(tài)性。圖5A 顯示，在HP3 與F7 雜交組合的自交后代F2群體基因型中，編號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 為雜合個(gè)體，基因型為O2/o2；編號12 帶型不清晰。圖5B 顯示，在HP3 與N13-1雜交組合的自交后代F2群體基因型中，編號2、4、6、7、9、10、13 為雜合個(gè)體，基因型為O2/o2；編號1、3、5、8、11、12、14 帶型與親本N13-1一致，是純合顯性個(gè)體，基因型為O2/O2。同樣，圖5C 顯示，在HP 3與F 8雜交組合的自交后代F2群體基因型中，檢測的所有單株基因型均為雜合個(gè)體；在HP3 與F9 雜交組合的自交后代F2群體基因型中，編號為2、3、4、5、6、7、8、9、10 為雜合個(gè)體，基因型為O2o2；編號1、11、12帶型與親本F9 一致，是純合顯性個(gè)體，基因型為O2/O2。田間去除各組自交后代顯性純合植株，留下雜合基因型植株繼續(xù)回交或自交。

圖5 SSR 標(biāo)記phi057 檢測的F2 自交群體基因型結(jié)果Fig.5 Genotypes of F2 populations detected by SSR molecular marker phi057

3 討論

甜糯玉米可作為鮮食玉米，對人體具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，但是賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸等必需氨基酸含量并不高。將含o2突變基因的高賴氨酸玉米導(dǎo)入到甜玉米自交系，通過分子標(biāo)記輔助選擇創(chuàng)制高賴氨酸甜玉米材料，對于提高甜玉米營養(yǎng)價(jià)值具有較好的遺傳育種價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，自交系多黃29、丹3130、9046 等材料與CA335雜交的后代全為o2/o2隱性純合個(gè)體［13］，而它們與CA339 用phi057 標(biāo)記無多態(tài)性。本研究SSR標(biāo)記phi057 發(fā)現(xiàn)，受體親本與供體親本均有多態(tài)性。有研究利用山東 2548 和齊205 作為供體、11份玉米自交系作為受體，未能構(gòu)建o2近等基因系［14］，這說明親本間有無多態(tài)性應(yīng)值得考究。本研究擬利用HP3 構(gòu)建o2近等基因系。在利用phi057 構(gòu)建近等基因系時(shí)，必須檢測供體與受體親本之間的多態(tài)性，選擇存在多態(tài)性的兩個(gè)親本雜交才能成功構(gòu)建材料。本研究發(fā)現(xiàn)，phi057 標(biāo)記不僅在供體和受體之間存在多態(tài)性，而且利用phi057 標(biāo)記能夠成功地檢測將來源于供體的o2基因?qū)胧荏w系。普通玉米胚乳蛋白質(zhì)中由醇溶蛋白組成，且賴氨酸含量僅70%，o2突變體能顯著增加非醇溶蛋白含量，從而極大提高籽粒中色氨酸和賴氨酸的含量［15-17］。但o2突變基因在不同玉米遺傳背景中的作用具有很大差異，α-醇溶蛋白、賴氨酸含量變化幅度差異極大［18-21］。分子標(biāo)記輔助選擇雖然能夠準(zhǔn)確地篩選導(dǎo)入純合o2/o2基因型的植株，但是轉(zhuǎn)育后不同材料間的賴氨酸含量增加幅度變化較大，這給選育高賴氨酸玉米增加了難度［22-23］。

本研究通過SSR 分子標(biāo)記phi057 篩選鑒定o2突變基因轉(zhuǎn)入甜糯玉米在其子代中的傳遞，把o2基因?qū)氲教鹋从衩鬃越幌抵校云趧?chuàng)制雙隱性o2/sh2-NILs 甜玉米近等基因系，建立一套在甜玉米中導(dǎo)入o2的分子標(biāo)記輔助育種方法。通過此方法向不同遺傳背景的甜糯玉米導(dǎo)入o2，選取賴氨酸含量提高較大、表型透光程度差異明顯的o2/sh2或o2/wx-NILs，作為后代育種的基本材料。

本研究僅開展了2 代篩選鑒定，材料還沒有穩(wěn)定，基因尚處于回復(fù)和純合過程，需要繼續(xù)開展選育和鑒定研究。而且成功構(gòu)建o2近等基因系后還需要檢測玉米賴氨酸含量，以驗(yàn)證導(dǎo)入o2基因?qū)μ岣咛鹋从衩踪嚢彼釥I養(yǎng)的可行性。研究表明，o2突變后糯玉米籽粒表型同甜玉米表型變化基本一致，都是由蠟質(zhì)表型變成不透明的粉質(zhì)表型，可見糯玉米籽粒表型的變化與普通o2突變體一致，可能還會導(dǎo)致高賴氨酸糯玉米不易儲存，易遭病蟲害侵食，但該論點(diǎn)在本試驗(yàn)中未得到證實(shí)［24-25］。

4 結(jié)論

本研究以1 份優(yōu)質(zhì)蛋白玉米材料HP3 為供體，將o2基因轉(zhuǎn)入9 份甜玉米和1 份糯玉米自交系材料，SSR 標(biāo)記phi057 在供體和受體自交系o2基因中呈現(xiàn)良好的多態(tài)性，在回交和自交后代中能夠檢測到供體的o2基因成功導(dǎo)入甜糯玉米受體自交系。供體親本籽粒背面凹陷且皺縮，在投射光下籽粒不透明；甜玉米外觀干癟皺縮，糯玉米籽粒飽滿且有光澤，且甜糯玉米透光性好；但o2基因轉(zhuǎn)入后，F(xiàn)1代甜質(zhì)玉米表現(xiàn)出硬質(zhì)、皺縮不同類型的籽粒分離狀態(tài)，BC1代則明顯表現(xiàn)出透光性降低，與供體親本特點(diǎn)相吻合。在回交和自交后代中通過籽粒表型與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法，初步創(chuàng)制了10 組優(yōu)質(zhì)甜/糯玉米早代群體系，研究建立了一個(gè)快速、有效的分子標(biāo)記輔助選擇改良鮮食玉米品質(zhì)的方法。