牟開萍，李維芳，楊文新，李昌霞，王春蕾，廖偉彪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

月季(Rosachinensis)為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)花灌木，是我國的傳統(tǒng)名花，因具有種類繁多、花色花型豐富、花期長、觀賞價值高、適應(yīng)性強(qiáng)等特點，被認(rèn)為是當(dāng)今世界最重要的觀賞植物之一。月季在我國南方的城市園林綠化中應(yīng)用廣泛，但北方寒冷地區(qū)由于低溫條件的限制，月季露地越冬存在一定的困難，這對其新品種的推廣和發(fā)展有很大的影響。有些月季品種在寒冷、干旱、高鹽堿等逆境下雖能勉強(qiáng)存活，但品質(zhì)卻下降許多，因此培育抗逆性強(qiáng)的月季品種具有十分重要的意義。近幾年，越來越多的科研工作者開始進(jìn)行月季的抗寒[1-2]、抗旱[3-4]、耐鹽[5-7]等抗逆性研究。

低溫是非生物脅迫中的一個關(guān)鍵因子，它會限制植物的生長和地理分布[8-9]。低溫脅迫會降低光合作用，使植物體內(nèi)水分和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運速度減慢，另外還會使胞內(nèi)溶液凍結(jié)、細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷、細(xì)胞功能紊亂，對植株造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。目前已有不少學(xué)者對月季的抗寒性做了鑒定與比較，但由于其種類繁多、種間差異大，且研究方法和測定手段仍有一定的局限性，對月季響應(yīng)低溫的研究機(jī)制一直沒有突破性的進(jìn)展[10-11]。早期人們常以相對電導(dǎo)率作為評價植物抗寒性的指標(biāo)，然而越來越多的結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種方法不夠全面和準(zhǔn)確，所以最近幾年應(yīng)用更多的是通過多項指標(biāo)來進(jìn)行綜合分析，其中用隸屬函數(shù)法評價植物抗寒能力具有較強(qiáng)的可靠性，因而被普遍應(yīng)用。此外，灰色關(guān)聯(lián)分析是一種多因素統(tǒng)計的方法，可以真實全面地反映事物的客觀特征[12]；主成分分析法可以克服多個指標(biāo)間的信息重疊，將各原始指標(biāo)轉(zhuǎn)換成少數(shù)彼此獨立的綜合評價指標(biāo)，提高評價指標(biāo)的可靠性[13]。本研究以蘭州植物園的20個月季品種一年生枝條為供試材料，對所測指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，以低溫脅迫后各指標(biāo)的相對值作為抗寒性評價指標(biāo)，通過主成分分析法和隸屬函數(shù)法對各月季品種的抗寒性作出鑒定和評價，旨在為寒冷地區(qū)冬季月季的選育和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2019年11月于蘭州植物園選取20個月季品種(表1)，取各品種長勢均勻、粗度基本相同的一年生枝條作為供試材料，單株樣枝充分混合后備用。

表1 供試月季品種

1.2 試驗方法

將采回的月季品種一年生枝條用自來水和蒸餾水沖洗干凈，取中下部分剪成20 cm長的枝段，剪切口處用封口膜包裹后進(jìn)行處理。以4 ℃作為對照溫度，-10 ℃為低溫處理溫度，將月季品種在以上兩個溫度下各處理48 h后測定指標(biāo)。每個品種在不同溫度梯度下各用5個枝段，各試驗均設(shè)3個重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測定

將低溫處理后的月季枝段在25 ℃下水培，每天調(diào)查發(fā)芽枝數(shù)和累計發(fā)芽數(shù)，待發(fā)芽數(shù)恒定后，計算枝條存活率(SR)和發(fā)芽率(GR)，以此作為月季恢復(fù)生長能力的指標(biāo)[2]；相對電導(dǎo)率(RC)的測定采用電導(dǎo)儀法，MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法，可溶性糖含量(SS)和可溶性蛋白含量(SP)分別用蒽酮-乙酸乙酯法和考馬斯亮藍(lán)法測定[14-15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用各指標(biāo)的相對值(抗寒系數(shù))對不同品種月季的抗寒性進(jìn)行評價，所用公式為：抗寒系數(shù)(%)=低溫脅迫后指標(biāo)測定值/對照指標(biāo)測定值×100%[16]；采用主成分分析法將各單項指標(biāo)的抗寒系數(shù)轉(zhuǎn)化為若干個綜合指標(biāo)，并運用隸屬函數(shù)法對其進(jìn)一步分析，通過計算隸屬函數(shù)值、權(quán)重和D值來評定各品種的抗寒性強(qiáng)弱，最后對D值進(jìn)行聚類分析，使用Ward’s method分層聚類法，樣本之間的距離為歐式距離平方，得出聚類分析譜系圖[17]。

運用Microsoft Excel 2010進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析、抗寒系數(shù)、隸屬函數(shù)等的相關(guān)計算，SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對20個月季品種抗寒性指標(biāo)的影響及各指標(biāo)抗寒系數(shù)

20個月季品種在受到低溫脅迫后，枝條存活率和發(fā)芽率平均下降了52.27%和33.57%，表明低溫影響了枝條的恢復(fù)生長能力；相對電導(dǎo)率較對照平均上升了127.00%，MDA含量變化規(guī)律不一致，如‘電子表’‘緋扇’‘摩納哥公主’平均下降了53.23%、19.45%、17.61%，而‘金鳳凰’‘艷麗’‘紅雙喜’平均上升了124.91%、140.93%、124.67%，體現(xiàn)了各品種月季體內(nèi)質(zhì)膜對逆境響應(yīng)的差異性；可溶性糖含量和可溶性蛋白含量較對照平均下降了54.73%和87.40%，究其原因為低溫使得月季枝條細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)遭到了破壞。此外，試驗還發(fā)現(xiàn)，在-10 ℃低溫脅迫后，‘亞克力紅’‘金獎?wù)隆瘌P凰’‘榮光’和‘節(jié)日禮花’的枝條和葉片受傷害嚴(yán)重，表現(xiàn)為部分枝條死亡，葉片逐漸發(fā)黃、萎蔫或干枯；‘艷麗’‘紅蓯蓉’‘黃和平’‘摩納哥公主’的葉色變暗、萎蔫變軟，部分葉片皺縮，枝條活性降低；‘香魔’‘贊歌’‘阿爾卑斯’‘香妃’‘百老匯’受傷害程度小，葉色基本正常，葉緣失水萎蔫，發(fā)芽率較高；其他月季品種也有不同程度的受害表現(xiàn)(表2)。

表2 低溫脅迫處理下20個月季品種的抗寒性指標(biāo)

為了便于分析，利用表2數(shù)據(jù)計算得到各品種月季單項指標(biāo)的抗寒系數(shù)。不同指標(biāo)的抗寒系數(shù)間差異較大，其中‘贊歌’的枝條存活率抗寒系數(shù)最大，為100%，‘香魔’的發(fā)芽率抗寒系數(shù)最大，為183.33%，表明這兩種月季的抗寒性較強(qiáng)，‘亞克力紅’的這兩項抗寒系數(shù)均低于其他品種，說明其抗寒性較差；相對電導(dǎo)率和丙二醛含量抗寒系數(shù)最小的品種分別是‘香魔’(101.06%)和‘摩納哥公主’(17.61%)，反映出這兩種月季較強(qiáng)的抗寒性；‘黃和平’(342.86%)和‘百老匯’(127.27%)分別是可溶性糖含量和可溶性蛋白含量抗寒系數(shù)最大的品種，二者對低溫的耐受性強(qiáng)(表3)。

表3 20個月季品種各項指標(biāo)的抗寒系數(shù)

2.2 低溫脅迫下各指標(biāo)與抗寒性的灰色關(guān)聯(lián)分析

參照劉慧民等[18]、吳曉麗等[19]的方法，以低溫脅迫下各月季品種的相對電導(dǎo)率為參考序列(母序列)，記作X0，枝條存活率、發(fā)芽率、MDA含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量5項指標(biāo)為比較序列(子序列)，記作Xi(i=1，2，3，4，5)，建立灰色關(guān)聯(lián)分析系統(tǒng)。由于各指標(biāo)所含的物理意義不同，需對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理(式1)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)計算參考序列X0(相對電導(dǎo)率)與比較序列Xi(各指標(biāo))之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)與關(guān)聯(lián)度[19-20](公式2、3)，結(jié)果見表4。

(1)

ξi(k)=

(2)

(3)

各月季品種在低溫脅迫下的5個指標(biāo)與抗寒性的關(guān)聯(lián)度從小到大依次為0.67、0.70、0.72、0.73、0.74，均大于0.30，表明各指標(biāo)與抗寒性均有一定的相關(guān)性[21]。從關(guān)聯(lián)序列結(jié)果來看，各指標(biāo)中MDA含量對月季抗寒性的影響最大，其次為發(fā)芽率、存活率，可溶性蛋白和可溶性糖含量對抗寒性的影響較小(表4)。

表4 20個月季品種的抗寒性與各指標(biāo)的關(guān)聯(lián)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度、關(guān)聯(lián)序

結(jié)果同樣反映了各指標(biāo)對低溫脅迫的敏感程度[19]，表明供試月季在受到低溫為害后膜脂過氧化程度加重，進(jìn)而表現(xiàn)為枝條發(fā)芽率和存活率降低；可溶性蛋白和可溶性糖對細(xì)胞膜系統(tǒng)起保護(hù)作用，在低溫脅迫時可以緩解逆境對植物體的傷害。

2.3 抗寒性指標(biāo)的主成分分析

將20個月季品種各指標(biāo)的抗寒系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析，前4個主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到80.254%，包含了大多數(shù)的指標(biāo)信息，可以用來反映不同品種月季的綜合抗寒性(表4)。表中特征向量絕對值的大小反映了各指標(biāo)對主成分的影響程度，負(fù)值表示負(fù)向影響。根據(jù)主成分的特征向量得到4個主成分的得分函數(shù)表達(dá)式：

F1=-0.004X1-0.113X2+0.576X3-0.480X4-0.032X5+0.651X6

(4)

F2= 0.643X1+0.568X2+0.090X3+0.106X4-0.488X+0.077X6

(5)

F3= 0.248X1+0.373X2-0.435X3-0.499X4+0.590X5+0.113X6

(6)

F4=-0.419X1+0.572X2+0.171X3+0.510X4+0.307X5+0.336X6

(7)

式中：F1～F4表示主成分的綜合評價值，X1～X6表示以上6個指標(biāo)抗寒系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化之后得到的數(shù)值。由于4個主成分在評價抗寒性時所起的作用不同，因此對各綜合指標(biāo)進(jìn)一步用隸屬函數(shù)結(jié)合權(quán)重法分析。

2.4 隸屬函數(shù)綜合分析

由主成分分析得出4個綜合評價值(F1～F4)，按照公式(8)計算其隸屬函數(shù)值[22]，其中Xj表示第j個指標(biāo)，Xjmin與Xjmax分別表示j指標(biāo)的最小值與最大值。對同一綜合指標(biāo)而言，隸屬函數(shù)值越高的品種抗寒性越強(qiáng)。

μ(Xj)=(Xj-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(8)

(9)

(10)

根據(jù)各綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率計算其權(quán)重(式9)，進(jìn)而求得綜合抗寒能力D值(式10)。其中wj為第j個綜合指標(biāo)所占的權(quán)重，pj為各品種在第j各綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率[13,23]，D為各品種在低溫脅迫下的抗寒性綜合評價值[13]，D值越大則該品種的綜合抗寒性越強(qiáng)，對D值排序即為各品種月季的抗寒性排名。

各品種的D值在0.247～0.690，其中‘香魔’‘阿爾卑斯’‘百老匯’的D值最大為0.690、0.687和0.656，是20個月季品種中抗寒性最強(qiáng)的3個品種；‘火和平’和‘綠野’的D值相同，均為0.433；‘節(jié)日禮花’(0.339)、‘榮光’(0.290)和‘金鳳凰’(0.247)D值最小，即這3個品種的綜合抗寒能力最差(表6)。

表5 主成分的特征向量與累積貢獻(xiàn)率

表6 各月季品種的綜合評價值、權(quán)重、μ(Xj)、D值及抗寒性排名

2.5 聚類分析

采用系統(tǒng)聚類法，對20個月季品種抗寒能力的D值進(jìn)行聚類分析(圖1)。各月季品種按抗寒性強(qiáng)弱可劃分為5類：

圖1 20個月季品種抗寒能力的聚類分析

第1類：抗寒性最強(qiáng)，包括‘香魔’‘香妃’‘百老匯’。

第2類：抗寒性較強(qiáng)，包括‘贊歌’‘阿爾卑斯’‘電子表’。

第3類：抗寒性一般，包括‘艷麗’‘紅蓯蓉’‘緋扇’‘愛’‘黃和平’。

第4類：抗寒性較差，包括‘摩納哥公主’‘綠野’‘火和平’‘紅雙喜’‘亞克力紅’‘金獎?wù)隆?/p>

第5類：抗寒性最差，包括‘金鳳凰’‘榮光’和‘節(jié)日禮花’。

各品種月季的抗寒性排序與低溫脅迫后的外部形態(tài)表現(xiàn)基本一致，表明本研究結(jié)果可信度較高，同時也體現(xiàn)了主成分分析和隸屬函數(shù)綜合評價方法的可靠性。

3 討論

在植物的非生物性脅迫中，低溫危害是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的主要自然災(zāi)害之一，不但影響其品質(zhì)與產(chǎn)量，嚴(yán)重時還可造成植株死亡，對植物的觀賞價值、生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)價值等都造成很大的損失[24]。如今，抗寒性研究已成為植物抗逆研究中的一個重要組成部分，正確、科學(xué)的測定和評價植物的抗寒能力對于物種保護(hù)、育種栽培等都具有十分深刻的意義。本研究通過對20個月季品種綜合抗寒能力的評定，篩選出了抗寒性較強(qiáng)的6個品種‘香魔’‘香妃’‘百老匯’‘贊歌’‘阿爾卑斯’‘電子表’，為寒冷地區(qū)冬季植物的選育和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

鑒定植物抗寒性的指標(biāo)有很多，本研究選取了最有代表性的6項進(jìn)行研究，其中枝條存活率和發(fā)芽率是評價植物受害程度或能否繼續(xù)生存的最直觀方法[2,25-26]。相對電導(dǎo)率和MDA含量可以直接反映出植物細(xì)胞膜透性及膜脂過氧化程度，進(jìn)而反映出植物的抗寒性；可溶性糖和可溶性蛋白是與植物抗逆性密切相關(guān)的兩種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以在低溫時避免其原生質(zhì)受到脫水傷害[27]。此前張雙群等[2]、張濤等[25]在藤本月季抗寒性的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，各月季品種枝條受到不同程度的傷害，枝條存活率和發(fā)芽率逐漸降低，可溶性蛋白含量逐漸升高，這與本研究的結(jié)論一致。劉璐等[28]的研究表明，低溫脅迫下地被月季的相對電導(dǎo)率和MDA含量逐漸上升，且在-10 ℃下達(dá)到最大值，而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分月季品種在低溫下這兩個參數(shù)值不升反降，筆者認(rèn)為造成差異的原因可能是植株類型、品種及處理方法的不同所致，對此也有類似的報道，如高福元等[29]得出了不同樹種在低溫下丙二醛變化規(guī)律不同的結(jié)論。焦美玲等[30]對4種豐花月季的根系抗寒性做出比較，結(jié)果表明可溶性糖含量會隨溫度的降低而升高，朱曉非等[31]在微型月季的研究中也得出了同樣的結(jié)論，為我們的結(jié)果提供了有力的支撐。本研究通過灰色關(guān)聯(lián)分析和主成分分析，發(fā)現(xiàn)MDA含量、枝條存活率與發(fā)芽率對月季抗寒性的影響較大。

在植物的低溫脅迫試驗中往往會設(shè)置不同的溫度梯度，通過將對照與處理溫度下各性狀的變化做比較，對其抗寒性作出評價。本研究選擇4 ℃為對照溫度，此前已有學(xué)者在藤本月季[2]、棗樹[32]、杏樹[33]、大葉鐵線蓮[34]等植物的抗寒性評價中都以此溫度為對照，這也是相關(guān)人員根據(jù)北方寒冷地區(qū)冬季室外溫度的觀察和總結(jié)得出的普遍結(jié)果。另外在抗寒性研究中應(yīng)用較多的是以室溫為對照，研究人員可根據(jù)具體植物的生理特性及試驗?zāi)康?、環(huán)境條件選擇合適的對照溫度。本研究結(jié)合主成分分析、隸屬函數(shù)綜合分析及聚類分析，將6個抗寒性指標(biāo)的抗寒系數(shù)轉(zhuǎn)化為4個獨立的綜合指標(biāo)，按照綜合評價值D值的大小對20個月季品種的抗寒性做了評定與分類，評價結(jié)果與形態(tài)觀測結(jié)果基本一致，較為準(zhǔn)確地篩選了適合寒冷地區(qū)冬季栽培的月季品種。具體結(jié)果還應(yīng)結(jié)合實地條件綜合考慮，在生產(chǎn)實踐中進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

通過對蘭州地區(qū)20個月季品種進(jìn)行抗寒性比較與綜合評價，將其按照抗寒性強(qiáng)弱分為5類，其中‘香魔’‘香妃’‘百老匯’抗寒性最強(qiáng)，‘贊歌’‘阿爾卑斯’‘電子表’次之，這些品種適宜在寒冷地區(qū)選育栽培；‘艷麗’‘紅蓯蓉’‘緋扇’‘愛’‘黃和平’抗寒性一般，可在越冬時做適當(dāng)?shù)姆篮胧??！{哥公主’‘綠野’‘火和平’‘紅雙喜’‘亞克力紅’‘金獎?wù)隆购暂^差，不宜在寒冷地區(qū)露地越冬；‘金鳳凰’‘榮光’和‘節(jié)日禮花’抗寒性最差，應(yīng)培育在較為溫暖的地區(qū)。