惠雅佞，羅永忠

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅蘭州730070)

水分是影響植物生理生態(tài)特性及生長發(fā)育的重要環(huán)境因子[1-2]，隨著水資源危機和干旱化危害的不斷加劇，植物如何適應(yīng)干旱已成為全球研究的熱點問題之一[3-6]。甘肅是西北地區(qū)牧草栽培大省，據(jù)統(tǒng)計，栽培的優(yōu)良牧草種類有47種，占整個西北牧草種的88.7%，栽培面積也以甘肅最大，其中，紫花苜蓿種植面積占牧草總面積的66.6%[7]，但甘肅省地處干旱半干旱地區(qū)，氣候干燥，降水量小，導(dǎo)致干旱成為甘肅省最常見、影響范圍最廣、損失最大的自然災(zāi)害[8]，所以牧草種植和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中選擇抗旱性強的植物極為重要，而研究植物的抗旱能力可從植物的根、莖、葉和種子入手[9-10]。其中，植物種子萌發(fā)期是植株成苗、生長的關(guān)鍵時期[11]，種子在萌發(fā)期如何對干旱做出響應(yīng)也是植物適應(yīng)干旱的重要策略。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是干旱半干旱地區(qū)廣泛種植且發(fā)展前景優(yōu)良的牧草品種，它具有產(chǎn)量高、適口性好、適應(yīng)性強等特點，素有“牧草之王”的美稱[12]。甘農(nóng)1號(Medicagosativacv.Gannong No.1)、新疆大葉苜蓿(Medicagosativacv.Xinjiangdaye)、中苜1號(Medicagosativacv.Zhongmu No.1)及中天1號(Medicagosativacv.Zhongtian No.1)是在甘肅乃至西北地區(qū)廣泛種植的4個優(yōu)良紫花苜蓿品種，均具有較強的抗旱性。甘肅地處黃土高原，牧草播種多在春秋季，但黃土高原冬季氣溫遠(yuǎn)低于0 ℃，在秋季播種苜蓿會導(dǎo)致其無法安全越冬，因此，紫花苜蓿常在4月播種[13-14]，但該地區(qū)春季降水量平均在80-100 mm之間，極大地限制了紫花苜蓿種子的萌發(fā)[15-16]，進而影響著苜蓿在甘肅的種植和畜牧業(yè)發(fā)展。聚乙二醇6000(Polyethylene glycol,PEG-6000)是一種高分子聚合物，具有很強的親水性，能夠奪取水分，對植物造成干旱脅迫，常作為水分脅迫劑應(yīng)用于干旱模擬[17]。目前國內(nèi)外利用PEG-6000模擬干旱脅迫的方法對各類植物種子萌發(fā)的影響研究較多[18-22]，對于甘肅廣泛種植的這4個紫花苜蓿品種在干旱脅迫下的萌發(fā)期抗旱性比較研究較少，因此本實驗通過采用PEG-6000模擬干旱的方法，測定不同濃度PEG-6000下4個紫花苜蓿品種的種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等萌芽指標(biāo)，對4種紫花苜蓿萌發(fā)期抗旱性做綜合評價，為甘肅乃至西北地區(qū)干旱半干旱區(qū)的牧草種植提供參考，并為植物節(jié)水農(nóng)業(yè)技術(shù)措施的制定提供理論依據(jù)與支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的4個紫花苜蓿品種為：甘農(nóng)1號、新疆大葉苜蓿、中苜1號及中天1號，種子凈度為96%～98%，均來自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子和培養(yǎng)皿處理 選擇成熟、飽滿、大小適宜、均勻一致且無病蟲害的4個紫花苜蓿品種的種子，參照《國際種子檢驗規(guī)程》[23-24]，先浸泡24 h，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的高錳酸鉀溶液浸泡30 min，進行消毒，之后用無菌水反復(fù)沖洗5～6次，用濾紙吸干備用。將玻璃培養(yǎng)皿(內(nèi)徑90 mm)放入高溫滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min[25]待用。

1.2.2 實驗設(shè)計 用不同濃度的PEG-6000溶液對4個紫花苜蓿品種的種子進行處理，即0%、5%、10%、15%、20%、25%(分別稱取0、5、10、15、20、25 g聚乙二醇，溶于蒸餾水中，并定容至100 mL)。苜蓿種子各設(shè)6個處理，每個處理各設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)各種50粒種子，發(fā)芽期10 d。在事先滅菌消毒過的培養(yǎng)皿中鋪設(shè)雙層大小與培養(yǎng)皿內(nèi)徑一致的濾紙，分別加入等量的不同濃度的PEG-6000溶液，直至濾紙飽和，稱其重量。之后將50粒種子均勻擺放在濾紙上，放入光照強度5 500 lx，相對濕度60%，溫度為25 ℃的人工智能氣候培養(yǎng)箱(光照/黑暗時間為12 h/12 h)中催芽[26](表1)。每天定時觀察并記錄種子萌發(fā)情況，用1/10000電子天平稱量培養(yǎng)皿的重量，并用蒸餾水補足損失的水分以保證PEG的濃度。

表1 實驗設(shè)計

1.3 測量指標(biāo)與方法

將3次重復(fù)中有1粒種子萌發(fā)時作為該處理種子發(fā)芽的開始，連續(xù)3 d沒有種子萌發(fā)作為發(fā)芽的結(jié)束，統(tǒng)計每天的發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽總數(shù)，并計算以下指標(biāo)：

1)發(fā)芽勢=4 d內(nèi)種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù)×100%

2)發(fā)芽率=10 d內(nèi)種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù)×100%

3)發(fā)芽指數(shù)=∑(GT/DT)

式中：GT為第t天的發(fā)芽數(shù)，DT為相應(yīng)的發(fā)芽時間(d)

4)抗旱指數(shù)=PEG脅迫下種子發(fā)芽指數(shù)/對照種子發(fā)芽指數(shù)

5)根芽比：種子發(fā)芽結(jié)束時，每個處理隨機選10株，測量其根長與芽長，計算根芽比[22]

1.4 抗旱性綜合評價方法

利用隸屬函數(shù)法[26]對4個紫花苜蓿品種進行綜合評價，隸屬函數(shù)值X(μ)如下式：

X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：X為某一紫花苜蓿某一指標(biāo)測定值的均值，Xmax、Xmin為某一紫花苜蓿品種某一指標(biāo)均值的最大值和最小值。如果某一指標(biāo)與抗性指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，則可以通過反隸屬函數(shù)計算其抗旱性隸屬函數(shù)值：

X(v)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

根據(jù)平均隸屬函數(shù)值大小確定抗旱性強弱并進行排序，平均值越大，抗旱性越強。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010整理數(shù)據(jù)并作圖,用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下4個紫花苜蓿品種的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的變化

PEG模擬干旱脅迫下，4個紫花苜蓿品種的種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率隨脅迫程度的加劇均呈下降趨勢，且新疆大葉苜蓿種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率在6種處理下均最大，并與其他3個紫花苜蓿品種的發(fā)芽勢和發(fā)芽率差異顯著(圖1)(P<0.05)。在PEG溶液濃度為5%時，中苜1號的發(fā)芽勢與新疆大葉苜蓿、甘農(nóng)1號和中天1號的發(fā)芽勢差異顯著(P<0.05)，其發(fā)芽勢比新疆大葉苜蓿降低了10.67%，比其他兩種分別增加了4%(甘農(nóng)1號)和5.33%(中天1號)；隨著干旱程度的加劇，在PEG溶液濃度達(dá)到25%時，新疆大葉苜蓿和中苜1號的發(fā)芽勢差異不顯著，但這兩個品種均與甘農(nóng)1號和中天1號的發(fā)芽勢差異顯著(P<0.05)，新疆大葉苜蓿(13.33%)是甘農(nóng)1號(7.33%)和中天1號(7.33%)的1.82倍，中苜1號(11.33%)是甘農(nóng)1號(7.33%)和中天1號(7.33%)的1.55倍(圖1-A)，在PEG溶液濃度為5%和15%時，4種紫花苜蓿品種間發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)，甘農(nóng)1號、新疆大葉苜蓿、中苜1號和中天1號在PEG濃度為5%和15%時的發(fā)芽率之比分別為80.67∶90.67∶77.33∶72.67和31.33∶54.67∶47.33∶15.33(圖1-B)。

圖1 不同脅迫下紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率

甘農(nóng)1號在PEG溶液濃度為15%、20%和25%下的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均差異顯著(P<0.05)；新疆大葉苜蓿在高濃度(15%、20%和25%)間的發(fā)芽勢、發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)；中苜1號在PEG溶液濃度為10%下的發(fā)芽勢和15%下的發(fā)芽勢、發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)，且這兩個濃度下的發(fā)芽勢與其他4個處理下的發(fā)芽勢差異顯著(P<0.05)；中天1號在低濃度(0%、5%、10%)下的發(fā)芽勢、發(fā)芽率與在高濃度(15%、20%、25%)下的發(fā)芽勢和發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)，且在低濃度之間也差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同干旱脅迫下4個紫花苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)和抗旱指數(shù)的變化

4個紫花苜蓿種品種的子的發(fā)芽指數(shù)和抗旱指數(shù)在PEG濃度從0%上升到25%的過程中，均呈現(xiàn)下降的趨勢。新疆大葉苜蓿的發(fā)芽指數(shù)在5種濃度處理下(除PEG濃度為15%外)均比其他3種紫花苜蓿的發(fā)芽指數(shù)大，且除PEG濃度為25%的處理下與其他3種紫花苜蓿的種子發(fā)芽指數(shù)差異不顯著外，在其他PEG濃度下與其他3種紫花苜蓿的種子發(fā)芽指數(shù)差異均顯著(P<0.05)。在PEG濃度為0%的情況下，新疆大葉苜蓿(37.25)的種子發(fā)芽質(zhì)量最好，其次是中苜1號(32.20)和中天1號(29.03)，種子發(fā)芽質(zhì)量最差的為甘農(nóng)1號(26.49)；當(dāng)PEG濃度達(dá)到25%時，4個紫花苜蓿品種的種子發(fā)芽指數(shù)差異不顯著(圖2-A)。PEG濃度達(dá)到20%以上時，4個紫花苜蓿品種間抗旱指數(shù)差異均不顯著，PEG濃度在低濃度(5%和10%)時，甘農(nóng)1號種子的抗旱指數(shù)與其他3個紫花苜蓿品種的抗旱指數(shù)差異顯著(P<0.05)。另外，PEG濃度為25%時，新疆大葉苜蓿的抗旱指數(shù)(0.109)最大，其余3個紫花苜蓿品種的種子的抗旱指數(shù)均不到0.1(圖2-B)。

圖2 4個紫花苜蓿品種的種子的發(fā)芽指數(shù)和抗旱指數(shù)

4個紫花苜蓿品種在PEG濃度為0%時的發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)與5%和25%下的發(fā)芽指數(shù)和抗旱指數(shù)差異顯著(P<0.05)，在PEG濃度為25%時，甘農(nóng)1號、新疆大葉苜蓿、中苜1號和中天1號的發(fā)芽指數(shù)較PEG濃度為0%時分別下降了91.39%、88.94%、90.15%和92.83%。PEG濃度從5%上升到25%的過程中，中天1號種子的抗旱指數(shù)下降最快，中苜1號的下降最慢，在PEG濃度達(dá)到15%時，中天1號的種子抗旱指數(shù)較PEG濃度為0%時降低了85.7%，中苜1號則降低了52.7%。

2.3 不同干旱脅迫下4種紫花苜蓿根芽比的變化

在各處理下甘農(nóng)1號的根芽比均最大，新疆大葉苜蓿的根芽比均最小。在PEG濃度為5%、20%和25%下，不同紫花苜蓿品種間根芽比差異顯著(P<0.05)，在PEG濃度從0%上升到25%的過程中，4種紫花苜蓿的根芽比大小為甘農(nóng)1號>中天1號>中苜1號>新疆大葉苜蓿(圖3)。

圖3 4個紫花苜蓿品種的根芽比

4個紫花苜蓿品種的根芽比在PEG濃度從0%上升到25%的過程中，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢：4個紫花苜蓿品種的根芽比在PEG濃度為5%時均大于其他PEG濃度。甘農(nóng)1號、中天1號、中苜1號和新疆大葉苜蓿的根芽比PEG濃度為5%較0%分別增加了14.78%、3.6%、2.95%和3.37%。中苜1號和新疆大葉苜蓿的根芽比在各個PEG濃度之間的變化較甘農(nóng)1號和中天1號緩慢：25%的PEG濃度較5%的PEG濃度，甘農(nóng)1號和中天1號分別降低了47.18%和43.54%，中苜1號和新疆大葉苜蓿分別降低了40.31%和40.48%。

2.4 4個紫花苜蓿品種的種子抗旱性綜合評價

對不同PEG濃度下4個紫花苜蓿品種萌芽期的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)和根芽比進行二因素方差分析(表2)，紫花苜蓿的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)和根芽比在不同PEG濃度下有極顯著變化(P<0.01)，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和抗旱指數(shù)4項萌芽指標(biāo)在不同品種間也有極顯著變化(P<0.01)，不同品種間根芽比呈顯著差異(P<0.05)，但不同PEG濃度及紫花苜蓿品種二者交互作用對紫花苜蓿的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)和根芽比無顯著影響。

表2 PEG濃度、苜蓿品種及二者的交互作用對紫花苜蓿種子發(fā)芽指標(biāo)的雙因素方差分析(F值)

利用隸屬函數(shù)法對4個紫花苜蓿品種的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)和根芽比進行綜合評價，得到4個紫花苜蓿品種的抗旱指標(biāo)隸屬函數(shù)值(表3)。根據(jù)隸屬函數(shù)值的平均值進行排序，得出4個紫花苜蓿品種的種子萌發(fā)期抗旱性強弱依次為甘農(nóng)1號>中苜1號>新疆大葉苜蓿>中天1號，中苜1號和新疆大葉苜蓿隸屬函數(shù)值的平均值差異不顯著，表明兩者的抗旱性差異不明顯。

表3 4個紫花苜蓿品種抗旱指標(biāo)隸屬函數(shù)值及抗旱性綜合評價

3 討論

種子萌發(fā)期是植株成活的關(guān)鍵時期，也是對水分響應(yīng)敏感的階段，種子萌發(fā)期的抗旱性強弱直接影響著植株后期的生長發(fā)育[27]，因此，研究種子萌發(fā)期的抗旱性有著直接的現(xiàn)實意義。發(fā)芽率能夠反映種子品質(zhì)的優(yōu)劣；發(fā)芽勢表征著種子的活力、出苗整齊度；發(fā)芽指數(shù)能反映種子發(fā)芽的質(zhì)量；抗旱指數(shù)能很好地反映出材料間抗旱性的差異[28-30]。本研究中，4種紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和抗旱指數(shù)種間差異顯著，可能是因為種子的生理狀態(tài)(成熟度)不一，通常情況下，成熟度越好，種子就具有較高且保持時間較長的活力，能夠為其萌發(fā)提供的營養(yǎng)物質(zhì)就越充足，發(fā)芽指標(biāo)值也就越高；種子的成熟度不高或較差時，難以獲得較高的活力，種子發(fā)芽就會受到影響[31]。大量研究表明[32-35]，利用不同濃度的PEG溶液模擬干旱脅迫對不同牧草的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、抗旱指數(shù)等的研究，可初步判定植物整體的抗旱性。有研究表明，隨干旱脅迫的加劇，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、抗旱指數(shù)呈下降趨勢，如董浩等[36]研究發(fā)現(xiàn)隨著脅迫濃度的升高，黑麥草、鼠茅草、二月蘭和毛葉苕子4種種子的發(fā)芽率和抗旱指數(shù)不斷下降；李靜靜等[37]認(rèn)為，PEG-6000脅迫處理后不同基因型小麥品種的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均受到抑制，但不同品種的降幅存在顯著差異。本研究同樣采用PEG模擬干旱的方法，發(fā)現(xiàn)4種紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和抗旱指數(shù)隨干旱脅迫的加劇呈下降趨勢，這與前人[38]的研究結(jié)果一致。也有研究表明，低濃度的PEG溶液對植株萌芽有促進作用，如曾怡[39]關(guān)于垂穗披堿草和老芒麥的研究發(fā)現(xiàn)，PEG溶液濃度為5%時，對兩者的主根長和根芽比均有促進作用；肖亮等[40]發(fā)現(xiàn)5%的PEG溶液對芒草幼苗的胚根生長有促進作用，對胚芽生長有抑制作用；孫清洋等[41]研究表明隨著PEG濃度的增加4種老芒麥幼苗胚根長先升后降。本研究表明，4種紫花苜蓿在PEG濃度為5%時，根芽比最大，未受PEG脅迫時次之，該結(jié)論與上述結(jié)果相一致，說明PEG濃度為5%時可促進根的形成，高濃度的PEG溶液對其有抑制作用。據(jù)報道，在低濃度(5%)的PEG溶液脅迫下植物吸收的營養(yǎng)物質(zhì)先供給地下部分(胚根)，利于植株存活，根芽比較未受脅迫時增大，但當(dāng)干旱脅迫加劇，根部不能吸收到更多的營養(yǎng)物質(zhì)時，胚芽的生長加劇，以提高光合作用，為植株供給營養(yǎng)，根芽比較未受脅迫時減小[42-43]。當(dāng)然，低濃度的PEG溶液對植物幼苗根的形成是否具有促進作用，也可能與植物的品種和植物對水分的敏感度有關(guān)[44]。

植物的抗旱性是一個受多種因素影響的復(fù)雜性狀，不能單純地用一兩個指標(biāo)說明，應(yīng)根據(jù)研究目的選用多個指標(biāo)綜合評價，才能比較客觀地表現(xiàn)植物的抗旱性[45]，而對于苜?？购敌栽u價的指標(biāo)篩選，前人們已做了很多研究，從本研究結(jié)果不難看出僅根據(jù)各項單一指標(biāo)對4種紫花苜蓿的抗旱性進行排序的結(jié)果非常不一致，而對這些指標(biāo)進行隸屬函數(shù)值的計算，取其平均值，然后排序，既消除了個別指標(biāo)產(chǎn)生的片面性，又由于平均值是[0，1]區(qū)間上的純數(shù)，使各紫花苜蓿品種抗旱性差異具有可比性，所以采用隸屬函數(shù)法進行綜合評價更具有可行性和可靠性和科學(xué)性[44-46]。本研究選取發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)和根芽比作為評價4種紫花苜蓿萌發(fā)期抗旱性的指標(biāo)，分別分析了不同濃度的PEG溶液對4種紫花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)和幼苗根芽比的影響，采用隸屬函數(shù)法進行綜合評價排序，結(jié)果表明4種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的抗旱性強弱順序依次為甘農(nóng)1號>中苜1號>新疆大葉苜蓿>中天1號，曾澤堂等[47]綜合分析得出甘農(nóng)1號紫花苜蓿種子的抗旱性強于新疆大葉苜蓿，楊姝等[22]對27份紫花苜蓿種質(zhì)抗旱性的研究表明中苜1號種質(zhì)的抗旱性高于新疆大葉苜蓿，這與本研究基本相同。本研究得出甘農(nóng)1號和中苜1號較其他2種苜蓿更適合在甘肅乃至整的西北地區(qū)種植，但本研究只對4種紫花苜蓿萌發(fā)期各指標(biāo)進行綜合評價，還需對4種紫花苜蓿在其他生育階段的抗旱性進行進一步比較。

4 結(jié)論

采用PEG-6000模擬干旱對4個紫花苜蓿品種萌發(fā)期的抗旱性進行研究，利用隸屬函數(shù)法對4個紫花苜蓿品種進行綜合評價，其萌發(fā)期抗旱性表現(xiàn)為甘農(nóng)1號>中苜1號>新疆大葉苜蓿>中天1號，因此，甘農(nóng)1號和中苜1號較其他2個紫花苜蓿品種更適合在甘肅乃至西北地區(qū)種植，但植物萌發(fā)期的抗旱性與其其他生育階段的抗旱性可能并不完全一致。因此，在萌發(fā)期抗旱性強的紫花苜蓿品種在其后期生長中是否依舊保持較強的抗旱性還需進一步試驗證明。