康翠翠,張妹,陳小嬌,陳文平
(北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司、國(guó)家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系平谷綜合試驗(yàn)站,北京平谷 101206)
目前,養(yǎng)禽業(yè)是我國(guó)主流畜牧養(yǎng)殖業(yè)之一,然而,隨著禽類(lèi)各種疾病的暴發(fā),對(duì)雞群的健康產(chǎn)生巨大的影響。 為了確保雞群健康,除做好生物安全外, 疫苗也是保護(hù)雞群健康必不可少的一員。 蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素含量是評(píng)價(jià)疫苗的兩種指標(biāo)。 疫苗中的蛋白質(zhì)含量過(guò)高會(huì)促使機(jī)體產(chǎn)生一些生物活性物質(zhì),進(jìn)而引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生反應(yīng)。而疫苗中的內(nèi)毒素會(huì)作用于單核巨噬細(xì)胞和多形核白細(xì)胞,進(jìn)而產(chǎn)生一些活性因子,導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[1]。 然而對(duì)于禽類(lèi)疫苗,目前尚未有關(guān)于蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素含量的明確規(guī)定。 本文對(duì)市場(chǎng)上的幾種禽類(lèi)疫苗進(jìn)行蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素檢測(cè), 擬了解目前禽類(lèi)疫苗蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素含量情況。
CBA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購(gòu)買(mǎi)自碧云天生物技術(shù)公司,鱟試劑(靈敏度0.25 EU/毫升)和細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(10 EU/支)均購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司, 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水購(gòu)自廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司。 各種禽用疫苗由各公司提供。 疫苗具體信息如表1。
表1 試驗(yàn)所用疫苗名稱(chēng)及廠家
1.2.1 總蛋白質(zhì)測(cè)定
1.2.1.1 前期處理
參考《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2078號(hào)》測(cè)定疫苗蛋白質(zhì)含量。 將疫苗從冰箱中取出使其恢復(fù)至常溫,上下顛倒使其混合均勻,從中取出100 微升置于1.5 毫升離心管中,加入900微升丙酮, 充分混勻后于室溫放置10 分鐘,15000 克4℃離心15 分鐘,去除上清液。 向沉淀中加入400 微升丙酮,震蕩后短暫離心,去除上清液。 再次用400 微升丙酮洗滌沉淀,震蕩后短暫離心去除上清液,將離心管蓋打開(kāi),室溫晾干直至沉淀物為粉末狀。 每管添加100 微升去離子水,置于超聲波中超聲20 分鐘,使其充分溶解。 每種疫苗重復(fù)3 次。
1.2.1.2 蛋白質(zhì)含量檢測(cè)
蛋白質(zhì)檢測(cè)流程嚴(yán)格按照CBA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行。
1.2.2 內(nèi)毒素檢測(cè)
1.2.2.1 疫苗前期處理
參考宋海巖等[2]的凍融方法, 取12 毫升混合均勻后的疫苗于15 毫升離心管中,置于-20℃冰箱冷凍48 小時(shí), 取出后使其于室溫中融化,完全融化后再次置于-20℃冰箱冷凍24 小時(shí), 取出后置于室溫中融化,3500 克離心15 分鐘,棄去上層乳狀物,吸取下層水相于5 毫升離心管中。
1.2.2.2 內(nèi)毒素限度試驗(yàn)
參考2015 年版《中國(guó)藥典》 中細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)方法。取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品一只,加入1 毫升檢查用水,旋渦混勻5 分鐘。后期利用檢查用水分別制備濃度為4λ 和2λ 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品液。 利用檢查用水進(jìn)行供試品稀釋?zhuān)?λ 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品液共同配制濃度為2λ 的供試品溶液。
取鱟試劑42 只,其中2 只為陰性對(duì)照管,2只為陽(yáng)性對(duì)照管, 其余每4 只用于一種疫苗的檢測(cè),2 只為供試品檢查管,2 只為供試品陽(yáng)性對(duì)照管。 每只鱟試劑中加入0.1 毫升檢查用水,其中陰性對(duì)照管再次加入0.1 毫升檢查用水,陽(yáng)性對(duì)照管加入0.1 毫升濃度為2λ 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,供試品檢查管加入0.1 毫升稀釋后的供試品,供試品陽(yáng)性對(duì)照管中加入濃度為2λ 的供試品溶液。 封閉鱟試劑管口,輕輕搖勻,將鱟試劑管垂直放入37℃恒溫箱中孵育60 分鐘,取出觀察,在取出過(guò)程中避免振動(dòng)。 將試管緩慢倒轉(zhuǎn)180°,若管底形成凝膠且凝膠不變形不從管壁脫落為陽(yáng)性,若管底未形成凝膠、凝膠變形或從管壁脫落均為陰性。 陰性對(duì)照管需為陰性,陽(yáng)性對(duì)照管和供試品陽(yáng)性管需為陽(yáng)性, 整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果才有效。
嚴(yán)格按照CBA 試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 如下圖1 所示,表中線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2=0.9995,顯著相關(guān)。
圖1 按照CBA 試劑盒制作的曲線(xiàn)
從表2 可知,按照生產(chǎn)廠家進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)不同廠家的疫苗蛋白質(zhì)含量不同。 綜合而言,除鋁膠苗外,B 廠家疫苗蛋白質(zhì)含量最高, 其次是廠家D, 兩家蛋白含量均在1000 微克/毫升以上; 廠家C 和F 蛋白含量在500~1000 微克/毫升內(nèi);廠家A 和E 蛋白質(zhì)含量在500 微克/毫升以下。
表2 各廠家各疫苗蛋白質(zhì)含量
按照單苗與聯(lián)苗進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)單苗和聯(lián)苗間蛋白質(zhì)含量并無(wú)明顯關(guān)系。
按照油苗和鋁膠苗進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)B 廠家中油苗中蛋白質(zhì)含量高于鋁膠苗。
取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一只用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解,旋渦混合后進(jìn)行稀釋?zhuān)瞥蓾舛葹?.50、0.25、0.125 和0.06 EU/毫升的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品。 取鱟試劑安剖瓶18 支,分別為陰性對(duì)照2 支,各濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品4 支。 將鱟試劑用0.1 毫升檢查用水溶解后,分別加入各濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品0.1 毫升,陰性對(duì)照管加入0.1 毫升檢查用水。 輕輕混勻后封閉管口,垂直放入37℃恒溫箱中60 分鐘,觀察結(jié)果。
從表3 可知, 鱟試劑復(fù)核結(jié)果中細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.50 EU/毫升時(shí)為陽(yáng)性,內(nèi)毒素濃度為0.06 EU/毫升時(shí)凝膠結(jié)果為陰性,說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有效。 本次靈敏度復(fù)核試驗(yàn)顯示本試驗(yàn)所用鱟試劑靈敏度為0.25 EU/毫升,與其標(biāo)識(shí)靈敏度一致。
表3 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果
按照中國(guó)藥典方法對(duì)各疫苗進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。 如表4 可知,8 種疫苗中有3 種疫苗內(nèi)毒素含量大于50EU/毫升,其余5 種疫苗含量均小于50 EU/毫升。
表4 各廠家各疫苗內(nèi)毒素含量
本文參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的檢測(cè)口蹄疫滅活苗蛋白質(zhì)含量方法對(duì)各種疫苗進(jìn)行總蛋白質(zhì)含量檢測(cè),參考中國(guó)藥典2015 版細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)方法檢測(cè)各疫苗內(nèi)毒素含量。 結(jié)果顯示不同疫苗其蛋白質(zhì)含量和內(nèi)毒素含量差異明顯,尤其是蛋白質(zhì)含量差異較大。 疫苗中雜蛋白質(zhì)含量過(guò)高可能會(huì)引起雞群局部發(fā)熱, 停食甚至死亡。
目前對(duì)于禽類(lèi)疫苗中蛋白質(zhì)含量未有明顯的規(guī)定。 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的口蹄疫疫苗中蛋白質(zhì)含量為小于500 微克/毫升, 疫苗內(nèi)毒素含量為小于50 EU/毫升。 本研究中疫苗蛋白質(zhì)含量最低為B 廠家的傳染性鼻炎 (A 型) 滅活疫苗(鋁膠苗)182 微克/毫升, 最高為B 廠家的禽腦脊髓炎滅活疫苗, 蛋白含量可達(dá)3822 微克/毫升,遠(yuǎn)超500 微克/毫升。兩種疫苗蛋白含量差距可達(dá)20 倍。 說(shuō)明疫苗蛋白質(zhì)含量與生產(chǎn)廠家無(wú)必要聯(lián)系,可能與疫苗制備工藝有關(guān)。 本文檢測(cè)的8 種疫苗中其中5 種疫苗蛋白含量超過(guò)500微克/毫升, 說(shuō)明目前禽用疫苗中蛋白質(zhì)含量較高。
疫苗中內(nèi)毒素含量是目前各方最為關(guān)注的問(wèn)題, 疫苗內(nèi)毒素含量過(guò)高會(huì)影響機(jī)體健康[2]。本研究檢測(cè)的8 個(gè)疫苗中有3 個(gè)疫苗內(nèi)毒素含量超過(guò)50 EU/毫升, 說(shuō)明大部分疫苗內(nèi)毒素含量低于50 EU/毫升。 此外內(nèi)毒素含量大于50 EU/毫升的疫苗分別屬于3 個(gè)廠家,說(shuō)明內(nèi)毒素含量的高低與廠家并無(wú)直接關(guān)系, 與各疫苗的制作工藝有關(guān)。
本文通過(guò)對(duì)市場(chǎng)上禽類(lèi)疫苗進(jìn)行蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素含量檢測(cè), 初步了解禽類(lèi)疫苗中蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的含量范圍, 為后期疫苗中蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的檢測(cè)提供了方法, 同時(shí)為疫苗的質(zhì)量評(píng)估提供了數(shù)據(jù)支撐。