二甲亞砜對綿羊精液低溫保存效果的影響

盛云，許靜*

（1.江蘇省盱眙縣盱城街道綜合服務(wù)中心江蘇淮安 211700；2.江蘇省盱眙縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所江蘇淮安 211700）

二甲亞砜是一種極性溶劑，跟水分子有很強(qiáng)的結(jié)合力并且易溶于水，可以快速通過細(xì)胞膜，使細(xì)胞快速脫水，降低冷凍液凝固點(diǎn)，從而減少細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶[1,2]。抗凍保護(hù)劑是為了防止低溫對細(xì)胞造成損傷如精子DNA 損傷而添加的一種物質(zhì)，抗凍保護(hù)劑主要分為滲透性和非滲透性抗凍保護(hù)劑，如甘油、丙二醇和本試驗中的DMSO 等滲透性抗凍保護(hù)劑，如卵黃、牛血清白蛋白和果糖等非滲透性抗凍保護(hù)劑[3-5]。甘油又稱丙三醇，是最早在綿羊精液中使用的通透性很強(qiáng)的抗凍保護(hù)劑，其可以降低胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，同時可以進(jìn)入精子內(nèi)部，減緩脫水速度，防止精子的滲透性損傷和細(xì)胞蛋白質(zhì)的變性，但過高濃度的甘油有一定的毒性作用，會導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)的損傷和酶活性的降低[6,7]。卵黃是大分子非滲透性抗凍保護(hù)劑，其中含有的卵磷脂和低密度脂蛋白可以附著在精子表面，降低精子的冷休克，另外卵黃還可以調(diào)節(jié)滲透壓和離子濃度，同時為精子的運(yùn)動和代謝提供能量，因此卵黃可以提高精液的保存品質(zhì)，但卵黃屬于動物源性的抗凍保護(hù)劑，存在一定的不穩(wěn)定性和疾病傳播感染的風(fēng)險[8-10]。因此為了避免動物源性抗凍保護(hù)劑和有毒害作用的甘油對精液的影響，本試驗在稀釋液中添加不同濃度的DMSO，通過采用CASA 檢測精液低溫保存期間的精子活率、活力、直線速率、曲線速率和路徑速率等，探究了DMSO 在綿羊精液低溫保存中的作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）試驗動物本試驗所用精液采自于江蘇綠森然有限公司提供的3 只健康湖羊，年齡為2 歲，湖羊膘情適宜，無任何疾病，體質(zhì)健壯。

2）主要試劑與藥品DMSO、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、果糖、檸檬酸、青霉素鈉和硫酸鏈霉素。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用含有0、0.5%、1%、2%和3%DMSO 的綿羊精液低溫保存稀釋液對綿羊精液進(jìn)行4℃低溫保存，每隔24h 輕輕翻動精液，防止精子沉淀聚積而產(chǎn)生損傷。在精液保存期間，每天采用CASA 對精子活率、活力、直線速率、曲線速率、路徑速率、鞭打頻率和擺動性進(jìn)行檢測，以評價不同濃度的DMSO 對綿羊精液低溫保存的作用效果。

1.3 試驗方法

1）稀釋液配置使用電子天平準(zhǔn)確稱取15.35g 的Tris、8.2g 的檸檬酸、10.00g 的果糖、0.15g 的青霉素鈉和0.35g 的硫酸鏈霉素，充分溶解于500.00mL 滅菌的超純水，配置成基礎(chǔ)稀釋液。分別取100.00、99.50、99.00、98.00 和97.00mL 的基礎(chǔ)稀釋液，分別加入0、0.5、1、2 和3mL 的DMSO，配置成DMSO 濃度為0（對照組）、0.5%、1%、2%和3%的稀釋液。

2）精液采集與稀釋采用假陰道法采集公羊精液，采精結(jié)束后，將精液置于37℃保溫杯，并在30min 內(nèi)帶回實(shí)驗室。對精液品質(zhì)進(jìn)行常規(guī)檢查，選取顏色、氣味和射精量正常的精液鏡檢，選取精子活力80%以上、畸形率低于15%的精液進(jìn)行混勻處理，采用預(yù)熱的含有不同濃度DMSO 的稀釋液進(jìn)行稀釋，然后用多層棉花包裹置于4℃冰箱。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，處理結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。每組設(shè)置有3 個重復(fù)，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 試驗結(jié)果

2.1 在低溫保存下不同濃度DMSO 對綿羊精子活率的影響

由表1 可知，添加不同濃度DMSO 的稀釋液在對綿羊精液低溫保存期間，在各時間段均能顯著提高精子活率（P＜0.05）。各處理組的精子活率隨著DMSO 濃度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且2%添加量的精子活率最高。保存1、5 和8d 時，2%處理組的精子活率顯著高于其它各組（P＜0.05）；保存2～4 和7d 時，2%、3%處理組的精子活率顯著高于其它各組（P＜0.05），但2%和3%處理組的精子活率差異不顯著；在保存6d 時，2%處理組的精子活率顯著高于對照組、0.5%和1%處理組的精子活率（P＜0.05），但與3%處理組的精子活率差異不顯著。

表1 在低溫保存下不同濃度DMSO對綿羊精子活率的影響（單位：%）

2.2 在低溫保存下不同濃度DMSO 對綿羊精子活力的影響

由表2 可知，添加不同濃度DMSO 的稀釋液在對綿羊精液低溫保存期間，在各時間段均能提高精子活力。各處理組的精子活力隨著DMSO 濃度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且2%添加量的精子活力最高。在保存1 和6d 時，1%、2%和3%處理組的精子活力顯著高于對照組和0.5%處理組的精子活力（P＜0.05）；保存2 和5d 時，2%處理組顯著高于對照組、0.5%和1%處理組的精子活力（P＜0.05），但與3%處理組的精子活力差異不顯著；保存3～4d 時，2%和3%處理組的精子活力顯著高于其它各組（P＜0.05），但2%和3%處理組的精子活力差異不顯著；保存7～8d 時，2%處理組的精子活力顯著高于其它各組（P＜0.05）。

表2 在低溫保存下不同濃度DMSO對綿羊精子活力的影響（單位：%）

2.3 在低溫保存下不同濃度DMSO 對綿羊精子運(yùn)動性能的影響

結(jié)果見表3，保存2d 時，1%和3%處理組的直線速率顯著高于對照組和2%處理組的直線速率（P＜0.05），但與0.5%處理組的直線速率差異不顯著；保存4d 時，0.5%處理組的直線速率顯著高于對照組和1%處理組的直線速率（P＜0.05），但與2%和3%處理組的直線速率差異不顯著；保存5d 時，1%處理組的直線速率顯著高于對照組、0.5%和2%處理組的直線速率（P＜0.05），但與3%處理組的直線速率差異不顯著；保存6d 時，1%處理組的直線速率顯著高于對照組和0.5%處理組的直線速率（P＜0.05），但與2%和3%處理組的直線速率差異不顯著；保存7d 時，3%處理組的直線速率顯著高于1%處理組的直線速率（P＜0.05），但與其它各組差異不顯著。

表3 在低溫保存下不同濃度DMSO對綿羊精子運(yùn)動性能的影響

保存1d 時，2%處理組的精子直線速率、曲線速率、路徑速率最高，但與其它各組差異不顯著；保存2d 時，各處理組的曲線速率、路徑速率均顯著高于對照組（P＜0.05），但各處理組間差異不顯著；保存3 和6d 時，2%處理組的曲線速率、路徑速率最高，且顯著高于對照組（P＜0.05），但與其它各組間差異不顯著；保存4d 時，2%處理組的曲線速率顯著高于對照組和0.5%處理組（P＜0.05），但與其它各組差異不顯著；保存5d 時，1%和2%處理組的曲線速率、路徑速率顯著高于其它各組（P＜0.05），但1%和2%處理組間的差異不顯著；保存7d 時，3%處理組的曲線速率、路徑速率顯著高于0.5%和1%處理組（P＜0.05），但與其它各組差異不顯著。

保存4d 時，2%處理組的精子鞭打頻率最高，但與其它各組差異不顯著；保存5d 時，2%處理組的精子鞭打頻率顯著高于對照組（P＜0.05）；保存2、5～6 和8d 時，2%處理組的精子擺動性顯著高于對照組（P＜0.05）。