吳志醫(yī),黃也,黃方,李凱,喻德躍,王慧

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

硫是植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)所必需的重要元素,是繼氮、磷、鉀之后的第四大營(yíng)養(yǎng)元素[1]。植物主要從土壤溶液中吸收硫酸鹽,以合成必需的有機(jī)硫化合物[2]。硫在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理代謝方面發(fā)揮重要的作用,缺硫影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、耐逆性以及作物的產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[3]。近年來,隨著人們環(huán)保意識(shí)的提高,工業(yè)含硫廢氣的排放和高硫燃料的使用受到了嚴(yán)格管控,含硫殺蟲劑、殺菌劑及除草劑用量也在不斷減少;耕地復(fù)種指數(shù)提高及高產(chǎn)作物的大規(guī)模種植,低硫或無硫化肥的施用量持續(xù)增加,這些因素都造成土壤中的硫素被大量消耗而得不到補(bǔ)給,導(dǎo)致土壤缺硫。2018年安徽省大規(guī)模的土壤樣品調(diào)查顯示,缺硫耕地面積約311.19×104hm2,占安徽省耕地總面積的53.1%,個(gè)別區(qū)域缺硫嚴(yán)重,超過80%[4]。大豆是喜硫作物,硫在大豆結(jié)瘤、固氮以及蛋白質(zhì)合成方面均有重要作用,缺硫會(huì)限制大豆葉面積增加,使葉綠素含量和硝酸還原酶活性降低,氮代謝受阻,嚴(yán)重影響大豆的正常生長(zhǎng)發(fā)育和食用品質(zhì)[5]。為應(yīng)對(duì)土壤缺硫,篩選優(yōu)異的耐低硫資源,解析耐低硫的分子機(jī)制,培育耐低硫的大豆品種,是解決這一困境的有效途徑之一。

人工誘變可創(chuàng)造大量的遺傳變異,是鑒定優(yōu)異資源和分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室早期利用60Co γ 射線和化學(xué)試劑甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate,EMS)對(duì)栽培大豆‘南農(nóng)86-4’和‘南農(nóng)94-16’進(jìn)行人工誘變,構(gòu)建了一個(gè)遺傳變異豐富的大豆突變體庫(kù)[6-8],通過對(duì)該突變體庫(kù)的鑒定,已從中篩選出多個(gè)遺傳穩(wěn)定的突變體,包括早花突變體elf1[8]、黃葉突變體cd1[9]、子葉折疊突變體coo[10]以及抗花葉病毒突變體[11]等。這些突變體的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了相關(guān)性狀功能基因的發(fā)掘和鑒定。

本研究利用室內(nèi)水培試驗(yàn)對(duì)大豆突變體群體中的165 份材料進(jìn)行不同硫水平處理,測(cè)定多個(gè)與低硫耐性相關(guān)的指標(biāo),旨在評(píng)價(jià)不同大豆突變體對(duì)低硫的耐性,并篩選穩(wěn)定的耐低硫和低硫敏感突變體,為大豆硫代謝的功能基因組研究和大豆品種培育提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料是由‘南農(nóng)86-4’和‘南農(nóng)94-16’經(jīng)理化因素復(fù)合誘變產(chǎn)生的大豆突變體群體,共有165個(gè)突變體株系,其中以‘南農(nóng)86-4’為親本的突變體創(chuàng)制于2003年和2005年[6],以‘南農(nóng)94-16’為親本的突變體創(chuàng)制于2002年和2003年[7],該群體經(jīng)過多年自交,在遺傳上已經(jīng)穩(wěn)定。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從每個(gè)大豆突變體材料中均挑選大小均一、表面光滑且無病斑的種子16粒,按照4×4的規(guī)格點(diǎn)播在裝有蛭石的花盆中,播種4 d后,挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗10株,移入對(duì)照(+S)和缺硫(-S)處理的營(yíng)養(yǎng)液中各5株,作為生物學(xué)重復(fù)。5 d后更換營(yíng)養(yǎng)液并去除子葉,再過5 d取樣,調(diào)查性狀。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì),重復(fù)3次(E1、E2、E3)。營(yíng)養(yǎng)液配制參照陳燕寧等[12]方法,略有改動(dòng)(表1)。對(duì)照為1/2霍格蘭德平衡營(yíng)養(yǎng)液,不含硫元素的1/2霍格蘭德營(yíng)養(yǎng)液作為缺硫處理,即把對(duì)照營(yíng)養(yǎng)液中MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CuSO4分別用MgCl2、FeCl2、ZnCl2、CuCl2代替。

表1 1/2霍格蘭德營(yíng)養(yǎng)液配方Table 1 1/2 Hoagland nutrient solution formula

由于水生環(huán)境下易染菌,為了避免苗期大豆根部受到污染,試驗(yàn)所用的蛭石、花盆和托盤均需提前進(jìn)行高溫滅菌處理。試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心人工氣候培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行,溫度為28～30 ℃,相對(duì)濕度為40%～48%,光照周期為16 h光照和8 h黑暗。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1 SPAD的測(cè)定用SPAD-502 PLUS葉綠素儀(柯尼卡美能達(dá),日本)測(cè)量倒2葉(新葉)的葉綠素含量(SPADnew)、真葉(老葉)的葉綠素含量(SPADold)。重復(fù)測(cè)定3次,取平均值作為測(cè)定值。

1.3.2 株高和根長(zhǎng)的測(cè)定株高指頂端生長(zhǎng)點(diǎn)到子葉節(jié)之間的距離,根長(zhǎng)指主根根尖到子葉節(jié)之間的距離。

1.3.3 生物量的測(cè)定以子葉節(jié)為界將植株分為地上部和地下部(根)。從子葉節(jié)處截?cái)?用吸水紙擦掉根表面的水分,然后迅速用千分之一電子天平稱量地上部鮮重和根鮮重。將鮮樣裝入已編號(hào)的牛皮袋中,放入105 ℃烘箱殺青0.5 h,再置于65 ℃烘干至恒重后稱重,得到地上部干重、根干重。計(jì)算鮮重根冠比和干重根冠比。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、差異顯著性分析、相關(guān)性分析以及繪圖。其中差異顯著性分析采用SPSS 20.0軟件中的獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)(Student’st-test),相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)法。

1.5 優(yōu)異突變資源篩選

計(jì)算倒2葉的葉綠素含量(SPADnew)和地上部干重在-S和+S條件下的比值(-S/+S),將這2個(gè)比值定義為耐低硫參數(shù),計(jì)算各大豆突變體株系在3個(gè)環(huán)境下耐低硫參數(shù)的平均值,據(jù)此篩選耐低硫和低硫敏感的大豆突變體。

2 結(jié)果與分析

2.1 低硫?qū)Υ蠖姑缙谛誀畹挠绊?/h3>

從圖1可見:突變體NJAU_M003幼苗在缺硫(-S)條件下,均出現(xiàn)葉片發(fā)黃、植株矮化、地上部生物量減少等癥狀。進(jìn)一步以葉綠素含量(SPADnew、SPADold)、株高、根長(zhǎng)、地上部鮮重和干重、根鮮重和干重為指標(biāo)評(píng)價(jià)大豆突變體群體對(duì)低硫的耐性。與+S條件相比,各突變體的根長(zhǎng)、鮮重根冠比、干重根冠比在-S條件下均極顯著增加,根干重在缺硫條件下略有增加,在E3環(huán)境下顯著高于對(duì)照(表2)。這些結(jié)果說明缺硫處理促進(jìn)苗期大豆根生長(zhǎng)和根部干物質(zhì)量積累,從而增強(qiáng)根部對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)元素的吸收能力,適應(yīng)缺硫環(huán)境。植株的葉綠素含量(SPADnew、SPADold)、株高、地上部鮮重和干重、根鮮重在-S條件下均降低(表2),在這些指標(biāo)中,地上部鮮重受低硫影響最強(qiáng)烈,與+S條件相比,-S條件下降幅達(dá)41.94%;SPADnew次之,降幅為25.55%;株高對(duì)低硫的響應(yīng)最弱,降幅為12.26%?？傊?缺硫?qū)Υ蠖雇蛔凅w地上部各性狀有抑制作用,但卻促進(jìn)根的發(fā)育。

圖1 在+S和-S條件下的大豆突變體NJAU_M003幼苗Fig.1 Seedlings of soybean mutation NJAU_M003 under +S and -S conditions+S:對(duì)照Control;-S:缺硫處理low-sulfur treatment. 下同The same below.

遺傳率分析表明,在+S和-S條件下,各性狀的遺傳率范圍分別是52.8%～88.4%、50.1%～84.8%(表2)。其中葉綠素含量在+S和-S條件下具有較高的遺傳率,說明葉綠素含量這一性狀受環(huán)境的影響較小,適合用作篩選極端材料的指標(biāo)。

表2 突變體群體表型的描述性分析和方差分析Table 2 Descriptive analysis and variance analysis of phenotypes in mutant population

續(xù)表2 Table 2 continued

2.2 低硫改變苗期大豆各性狀之間的相關(guān)性

從表3可見:大部分性狀在+S和-S條件下的相關(guān)性一致,根冠比與株高、地上部生物量之間顯著負(fù)相關(guān),與根生物量之間顯著正相關(guān),其他性狀之間均呈正相關(guān)關(guān)系。但不同硫水平下,一些性狀之間相關(guān)性不同。在+S條件下,倒2葉的葉綠素含量(SPADnew)與地上部干重、根干重之間顯著正相關(guān),根長(zhǎng)與地上部鮮重、根鮮重、地上部干重之間顯著正相關(guān),但在-S條件下,這些性狀之間的相關(guān)性均不顯著。反之,在+S條件下,根干重與干重根冠比之間無顯著相關(guān),但在-S條件下,根干重與干重根冠比之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系。另外,在+S條件下,地上部鮮重和根鮮重的相關(guān)系數(shù)為0.746,地上部干重和根干重的相關(guān)系數(shù)為0.836,這2個(gè)性狀的相關(guān)性在-S條件下減弱,相關(guān)系數(shù)分別為0.610和0.764。同樣,在-S條件下,地上部鮮重與鮮重根冠比之間、地上部干重與干重根冠比之間的負(fù)相關(guān)性減弱,而根鮮重與鮮重根冠比之間的正相關(guān)性增強(qiáng)。這些結(jié)果說明低硫?qū)π誀畹挠绊懜淖兞诵誀钪g原有的相關(guān)性,特別是地上部性狀和根性狀之間的關(guān)系。

表3 突變體群體在+S和-S條件下各表型的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of phenotypes of mutant population under +S and -S conditions

2.3 優(yōu)異突變體的篩選

從表2可見:葉綠素含量(SPADnew)遺傳率最高,而在低硫條件下具有更高的地上部干重(DWS)對(duì)大豆更有意義,因此基于這2個(gè)性狀計(jì)算耐低硫參數(shù),從大豆突變體庫(kù)中篩選對(duì)低硫表現(xiàn)為耐性和敏感的突變體。鑒于該突變體庫(kù)是由2個(gè)大豆品種突變而來,其遺傳背景差異較大,故在篩選極端材料時(shí)分2個(gè)亞群進(jìn)行。

基于2個(gè)指標(biāo)的-S/+S比值排序,共篩選出34個(gè)耐低硫大豆突變體和36個(gè)低硫敏感大豆突變體,其中來自‘南農(nóng)86-4’突變?nèi)后w的NJAU_M061、NJAU_M065和來自‘南農(nóng)94-16’突變?nèi)后w的NJAU_M099、NJAU_M115、NJAU_M128、NJAU_M134在2個(gè)指標(biāo)上對(duì)低硫處理都表現(xiàn)為耐性;來自‘南農(nóng)86-4’突變?nèi)后w的NJAU_M041、NJAU_M056和來自‘南農(nóng)94-16’突變?nèi)后w的NJAU_M101、NJAU_M125在2個(gè)指標(biāo)上對(duì)低硫處理都表現(xiàn)為敏感(表4)。

表4 基于葉綠素含量(SPADnew)和地上部干重(DWS)指標(biāo)篩選的優(yōu)異突變體資源Table 4 Excellent mutant resources screened based on chlorophyll content(SPADnew)and dry weight of shoot(DWS)

進(jìn)一步對(duì)在2個(gè)性狀上都表現(xiàn)為耐性或敏感的8個(gè)突變體以及‘南農(nóng)86-4’和‘南農(nóng)94-16’的表型進(jìn)行分析。在這些突變體中,NJAU_M115和NJAU_M134的倒2葉的SPADnew、DWS在-S與+S條件下均無顯著差異(圖2-A、B),說明這2個(gè)突變體對(duì)低硫不敏感,表現(xiàn)出較高的耐性。突變體NJAU_M101和NJAU_M125對(duì)低硫比較敏感,在-S條件下NJAU_M101的SPADnew降幅最大,達(dá)35.5%(圖2-A),NJAU_M125的地上部干重降幅最大,達(dá)55.5%(圖2-B)。

圖2 極端材料在+S和-S條件下的倒2葉的葉綠素含量(A)和地上部干重(B)Fig.2 SPADnew(A)and DWS(B)of extreme materials under +S and -S conditions

3 討論

3.1 大豆低硫耐性的篩選指標(biāo)

土壤硫缺乏主要發(fā)生在需硫量大的油料作物,大豆作為全球主要的油料作物同樣面臨著缺硫問題[13]。而大豆苗期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)對(duì)成熟期種子的產(chǎn)量及品質(zhì)形成至關(guān)重要,所以篩選苗期耐低硫的種質(zhì)資源對(duì)大豆育種具有十分重要的意義。大豆缺硫癥狀一般表現(xiàn)為葉片失綠,葉緣兩側(cè)呈棕色斑點(diǎn)、植株矮小、根瘤發(fā)育遲緩,進(jìn)而導(dǎo)致成熟期延遲、結(jié)籽量下降[14]。本研究對(duì)大豆突變體庫(kù)的165份材料進(jìn)行缺硫水培處理,結(jié)果表明缺硫處理使苗期大豆幼葉黃化、薄而脆,植株矮小,生物量降低,這與前人的研究結(jié)果一致。在本研究的10個(gè)指標(biāo)中,倒2葉的葉綠素含量(SPADnew)在對(duì)照和缺硫條件下均具有較高的遺傳率(表2),倒2葉的缺硫癥狀出現(xiàn)較早且十分明顯,因此該性狀可作為一個(gè)鑒定大豆耐低硫性的一個(gè)主要篩選指標(biāo)。大豆的經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要是種子和地上部秸稈,對(duì)于苗期大豆來講,地上部干重(DWS)是地上部生物量的一個(gè)重要指標(biāo),因此也可用來衡量大豆的低硫耐性。我們還發(fā)現(xiàn)倒2葉的SPADnew與DWS在+S條件下呈顯著正相關(guān),而在-S條件下無顯著相關(guān)性,這也表明這2個(gè)性狀可以作為獨(dú)立的評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)大豆低硫耐性進(jìn)行篩選。

3.2 缺硫重塑植物的株型

本研究中,苗期大豆在缺硫條件下地上部和根部的鮮重均顯著下降,但根鮮重下降的幅度比地上部鮮重小;地上部干重顯著下降,但根干重與對(duì)照之間并無顯著差異,從而導(dǎo)致鮮重根冠比和干重根冠比均顯著增加。在其他作物的缺硫研究也得出過相似的結(jié)論。楊慧仙對(duì)‘晉綠豆8號(hào)’‘晉豆19’和‘小紅蕓豆’進(jìn)行缺硫處理,發(fā)現(xiàn)3種豆科作物的根冠比在缺硫條件下均顯著增大[15]。甜菜在缺硫條件下根系與對(duì)照相比沒有明顯減少,主根長(zhǎng)勢(shì)減弱,但側(cè)根量增加,根冠比增大[16]。曾秀成等[17]對(duì)2個(gè)大豆品種進(jìn)行缺硫處理,結(jié)果顯示這2個(gè)品種根表面積未發(fā)生顯著變化,這使大豆根系在缺硫條件下維持了正常的吸收能力。這些研究說明光合產(chǎn)物在分配方向和強(qiáng)度上可能隨著營(yíng)養(yǎng)水平的改變而改變,缺硫條件下,光合產(chǎn)物分配到根部的比例較高,以促使根系生長(zhǎng),擴(kuò)大與外界環(huán)境的接觸面,盡可能多地獲取更多的營(yíng)養(yǎng),從而暫時(shí)彌補(bǔ)缺硫給植株帶來的不利影響[15]。

本研究評(píng)價(jià)了大豆突變體群體對(duì)低硫的耐性,并基于倒2葉的葉綠素含量(SPADnew)和地上部干重(DWS)篩選出穩(wěn)定的6個(gè)耐低硫和4個(gè)低硫敏感的突變體,其中耐低硫突變體葉綠素含量、地上部干重在缺硫條件下,相比于對(duì)照的下降幅度要遠(yuǎn)低于低硫敏感突變體,受低硫脅迫的影響較小。