曹 盼， 張櫻山， 魏學(xué)明， 王秉鵬， 潘慧清， 褚延斌

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥現(xiàn)代制藥工程研究院，甘肅 蘭州 730010)

烈香杜鵑為杜鵑花科植物烈香杜鵑RhododendronanthopogonoidesMaxim.的干燥花和葉[1]，又名小葉枇杷、白香柴、黃花杜鵑[2]，其味甘、澀，性平，具有清熱消腫和補(bǔ)腎功效，藏醫(yī)常用于治療培根病、肺病、脾胃虛寒、消化不良、水土不服等癥狀[3]，為藏藥“達(dá)里”的來(lái)源植物之一[4]，主要含有黃酮類、揮發(fā)油、香豆素、萜類等化學(xué)成分[5-9]，黃酮類尤其豐富，具有抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抑菌、降壓及心血管系統(tǒng)方面的藥理作用[10-11]，主要分布于西藏、四川、甘肅等地[12]。中藥質(zhì)量控制須考慮“藥材源頭-制劑工藝-制藥裝備-中藥制劑”全過(guò)程，形成全程可追溯、可測(cè)量且質(zhì)量可反饋的“整體、辯證、動(dòng)態(tài)、全程”多要素的質(zhì)量觀[13]，制定合理的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是保證藥材質(zhì)量的基礎(chǔ)，是患者用藥安全、有效的關(guān)鍵基礎(chǔ)[14]，也是藥材有效檢驗(yàn)的依據(jù)[15]。

HPLC指紋圖譜具專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性和重復(fù)性好等特點(diǎn)[16]，能全面呈現(xiàn)藥材專屬圖譜。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定金絲桃苷含量并建立HPLC指紋圖譜以期更全面的控制烈香杜鵑藥材質(zhì)量，并結(jié)合SPSS聚類分析、主成分分析[17]和灰色關(guān)聯(lián)度分析及選擇具有代表性的指標(biāo)成分評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地烈香杜鵑質(zhì)量，為控制烈香杜鵑藥材質(zhì)量提供進(jìn)一步參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀、Waters 2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；XS205-DU型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；DZF-6050型真空干燥箱(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海恒科科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試劑與藥物 金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)111521-201909，純度94.9%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。HPLC用試劑為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.3 藥材 12批藥材分別采自拉薩(S1)、夏河藏醫(yī)院(S2)、青海(S3)、青海藥市(S4)、日多(S5)、榆中(S6)、小昭寺(S7)、黃河藥市1(S8)、黃河藥市2(S9)、昌都(S10)、甘南1(S11)、甘南2(S12)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為烈香杜鵑RhododendronanthopogonoidesMaxim.的干燥花和葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[18-20]報(bào)道。Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，10%～31%A；10～39 min，31%A；39～56 min，31%～42%A；56～70 min，42%～49%A；70～71 min，49%～10%A；71～86 min，10%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取金絲桃苷對(duì)照品4.32 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇制成質(zhì)量濃度為163.99 μg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，冷卻，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，依次稀釋至24.60、32.80、41.00、49.20、57.40、81.99 μg/mL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=27 273.04X+30 964.16(r=1.000 0)，在24.60～81.99 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密稱稱取藥材1.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得金絲桃苷峰面積RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取藥材1.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、18、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷峰面積RSD為0.35%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材1.0 g，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷峰面積RSD為1.04%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取金絲桃苷含量已知的藥材12份，每份約0.2 g，精密稱定，按50%、100%、150%水平加入對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷平均加樣回收率為91.51%～96.69%，RSD為1.47%。

2.9 樣品含量測(cè)定 取12批樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，平行3份，計(jì)算金絲桃苷含量，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可知，甘南1(S11)中金絲桃苷含量最高，其次是青海(S3)、青海藥市(S4)、榆中(S6)，昌都(S10)最低，可能是產(chǎn)地不同，海拔、土壤、氣候等生態(tài)條件差異，采集時(shí)間不一所致。

表1 金絲桃苷含量測(cè)定結(jié)果

2.10 特征圖譜方法學(xué)考察

2.10.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取藥材(S1)1.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，以10號(hào)峰(金絲桃苷)為參照，測(cè)得15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.53%，相對(duì)峰面積RSD均小于4.28%，表明該方法精密度良好。

2.10.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取藥材(S1)1.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、18、24 h在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以10號(hào)峰(金絲桃苷)為參照，測(cè)得15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.16%，相對(duì)峰面積RSD均小于5.13%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材(S1)1.0 g，共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以10號(hào)峰(金絲桃苷)為參照，測(cè)得15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.19%，相對(duì)峰面積RSD均小于5.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.11 HPLC指紋圖譜建立

2.11.1 圖譜生成 取12批樣品，每批1.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012A版)生成圖譜，見(jiàn)圖1，相似度分別為0.925、0.957、0.976、0.976、0.934、0.957、0.891、0.981、0.956、0.867、0.951、0.966，表明不同產(chǎn)地之間藥材所含成分差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，而且對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性；小昭寺(S7)、昌都(S10)相似度相對(duì)較低，可能由于產(chǎn)地、自然環(huán)境、采集時(shí)間存在差異，導(dǎo)致其所含成分含量有所不同。

圖1 藥材對(duì)照指紋圖譜(A)、12批樣品HPLC指紋圖譜(B)

通過(guò)與對(duì)照品比較，指認(rèn)出10號(hào)峰為金絲桃苷，由于其峰面積較大，分離度較好，而且所有樣品共有，故以其為參照，測(cè)得其他色譜峰相對(duì)保留時(shí)間為0.09%～1.88%，相對(duì)峰面積為16.31%～178.17%，表明不同產(chǎn)地藥材共有成分雖然一致，但其所含成分含量存在差異，可能與產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、采集時(shí)間等因素有關(guān)。

2.11.2 聚類分析 以共有峰峰面積為變量，采用SPSS 22.0軟件將其標(biāo)準(zhǔn)化，測(cè)度為歐氏距離的平方，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，類間距為10時(shí)，12批樣品可聚為4類，S1～S8為一類，S9、S12為一類，S10為一類，S11為一類，結(jié)合金絲桃苷含量可知，S11質(zhì)量最優(yōu)，S1～S8良好，S9、S12較差，S10最差。

圖2 共有峰面積聚類分析樹(shù)狀圖

2.11.3 主成分分析 以共有峰峰面積為變量，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，前4種主成分累積貢獻(xiàn)率為86.976%，即能反映藥材86.976%的信息，其中第一主成分特征值為6.816，貢獻(xiàn)率為45.441%；第二主成分特征值為2.826，貢獻(xiàn)率為18.838%。

表2 共有峰特征值

以主成分分析對(duì)應(yīng)的貢獻(xiàn)率為權(quán)重，對(duì)其得分進(jìn)行線性加權(quán)，建立綜合評(píng)價(jià)函數(shù)為Y=0.522PC1+0.175PC2+0.171PC3+0.089PC4，計(jì)算綜合評(píng)分并排序，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，S9綜合評(píng)分最高，即質(zhì)量最優(yōu)；S1、S10最低，即質(zhì)量最差。

表3 主成分綜合評(píng)分和排序

將共有峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-p14.1軟件，得到主成分分析二維分布散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖3。由此可知，不同產(chǎn)地藥材聚集在同一片區(qū)域中，與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖3 主成分分析二維分布散點(diǎn)圖

2.11.4灰色關(guān)聯(lián)度分析 將共有峰峰面積導(dǎo)入DPS9.01版軟件，進(jìn)行整體灰色關(guān)聯(lián)度分析，數(shù)據(jù)序列轉(zhuǎn)換方式為均值化，分辨系數(shù)為0.1，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，S3(青海)、S4(青海藥市)、S6(榆中)關(guān)聯(lián)度最高，S10、S12較低，表明不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量因其所含成分含量不同而有所差異。

表4 灰色關(guān)聯(lián)度分析關(guān)聯(lián)系數(shù)

3 討論

3.1 HPLC含量測(cè)定 金絲桃苷是烈香杜鵑中黃酮類化合物，含量相對(duì)較高，故選擇其作為指標(biāo)成分。分別考察了不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、75%甲醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇)、提取方法(超聲、振搖、回流)、提取時(shí)間(15、30、60、90 min)、溶劑量(25、50、75、100 mL)對(duì)金絲桃苷含量的影響，發(fā)現(xiàn)，以甲醇為溶劑、溶劑量50 mL、回流提取30 min時(shí)其含量最高。再進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，包括體積流量(0.9、1.0、1.1 mL/min)、柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、流動(dòng)相(①0～10 min，9%～30%A；10～41 min，30%A；41～58 min，30%～42%A；58～70 min，42%～49%A；70～71 min，49%～9%A；71～86 min，9%A；②0～10 min，10%～31%A；10～39 min，31%A；39～56 min，31%～42%A；56～70 min，42%～49%A；70～71 min，49%～10%A；71～86 min，10%A；③0～10 min，11%～32%A；10～39 min，32%A；39～56 min，32%～42%A；56～70 min，42%～49%A；70～71 min，49%～11%A；71～86 min，11%A)、色譜柱(PLUS1、PLUS2、PLUS3、shimndzu)、流動(dòng)相pH(pH2.5、3.0、3.5)，結(jié)果含量均無(wú)明顯差異，RSD%均小于3.0%，說(shuō)明該方法耐用性良好，色譜條件穩(wěn)定可靠，能夠有效控制藥材質(zhì)量。但因只測(cè)一種成分不具有代表性，故以后可以同時(shí)測(cè)定多種成分含量，并建立指紋圖譜，更能全面控制藥材質(zhì)量，便于臨床應(yīng)用。

3.2 指紋圖譜及相關(guān)分析 通過(guò)HPLC指紋圖譜對(duì)12批樣品進(jìn)行質(zhì)量分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)照指紋圖譜共有峰保留時(shí)間與各產(chǎn)地烈香杜鵑樣品基本吻合，除小昭寺(S7)、昌都(S10)外，其余10批相似度均大于0.92，小昭寺(S7)、昌都(S10)的藥材可能因?yàn)楫a(chǎn)地不同、生長(zhǎng)環(huán)境差異及采摘時(shí)間存在差異而導(dǎo)致相似度稍低；15個(gè)共有峰峰面積存在較大差異，說(shuō)明不同產(chǎn)地烈香杜鵑共有成分雖一致，但含量明顯存在差異，這可能與生長(zhǎng)環(huán)境等氣候土壤等因素有關(guān)。由于時(shí)間及其他條件影響，目前采集的烈香杜鵑樣品批次相對(duì)較少，后續(xù)將增加樣品批次，并采用其他技術(shù)對(duì)各共有峰作進(jìn)一步確認(rèn)，建立更明確的指紋圖譜模式。

運(yùn)用SPSS 22.0軟件對(duì)12批藥材進(jìn)行聚類分析，將其分為4類；通過(guò)主成分分析，降維提取了4個(gè)主成分，能夠反映86.976%的信息。但相似度評(píng)價(jià)、聚類分析、主成分分析的結(jié)果不一致，其原因可能是烈香杜鵑成分復(fù)雜，產(chǎn)地環(huán)境不一，相似度評(píng)價(jià)時(shí)特征峰校正不全面，導(dǎo)致一些信息缺失，所以各產(chǎn)地相似度較高；主成分分析分析中只提取了特征值大于1的四個(gè)主成分，但特征值小于1的其他成分仍存在影響，所以結(jié)果有偏差。通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度分析，從整體上考察了12個(gè)產(chǎn)地烈香杜鵑之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)S3、S4、S6關(guān)聯(lián)度最高，S2、S7次之，S10、S12較低。