熱應激對大鼠脾臟組織形態(tài)學及TLR2/4表達的影響

陳 玲，董 川，張志雷

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 體育教學部，甘肅 蘭州 730070；2.菏澤學院 體育與健康學院，山東 菏澤 274015)

隨著全球氣候的逐漸變暖，高溫已成為影響人類和動物健康的重要環(huán)境應激源之一.在外界的高溫環(huán)境刺激下，動物的體表溫度超出了自身體溫調節(jié)能力的范疇，進而對機體組織器官造成不同程度的損傷(熱應激).研究表明，熱應激不僅會影響機體的生長發(fā)育[1-2]、生產(chǎn)性能和繁殖性能[3-5]，也會導致其免疫機能紊亂[6]，進而增加許多疾病風險，對人體健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟構成很大的威脅.Toll樣受體(TLRs)作為一類位于哺乳動物細胞表面的跨膜信號受體，在機體的先天性和獲得性免疫應答中均發(fā)揮著關鍵性的調控作用.這種免疫應答反應不僅表現(xiàn)在宿主應對外源性病原微生物感染方面，也體現(xiàn)在識別內源性細胞損傷后釋放的危險信號方面[7].TLRs與其配體特異性結合后，可通過合成并分泌一系列細胞因子以及促進黏附分子的表達，從而激活宿主的免疫防御系統(tǒng)[8].TLRs基因家族內含有很多成員，目前在哺乳動物中至少鑒定到13個成員[9]，最具代表性且在免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮核心作用的成員是Toll樣受體2(TLR2)和Toll樣受體4(TLR4).TLR2在不同組織細胞中廣泛存在，但主要在巨噬細胞等免疫細胞中表達，在機體抵御外源微生物侵襲的先天性免疫中起重要調控作用[10-11].TLR4作為膜型Toll樣受體之一，也在機體的免疫應答和炎癥反應中發(fā)揮重要作用[11].

截至目前，關于熱應激對哺乳動物免疫相關組織器官中TLR2和TLR4基因表達影響的研究報道較少，且TLR2和TLR4在不同熱應激狀態(tài)下的生物學功能尚不明確.鑒于此，本研究通過建立不同高溫條件及不同持續(xù)時間的大鼠熱應激模型，比較觀察不同熱應激條件下脾臟的組織形態(tài)學差異,分析不同熱應激條件對脾臟中免疫相關基因TLR2和TLR4的表達及其編碼蛋白陽性信號分布位置的影響，旨在探究熱應激對大鼠脾臟組織結構以及TLR2和TLR4的表達調控作用，為更深入探究由TLR2/4介導的免疫相關通路在動物熱應激免疫防御中的分子調控機制提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡成年雄性Wistar大鼠，由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所動物實驗中心提供；焦碳酸二乙酯(DEPC)、RNA提取試劑、反轉錄試劑盒(StarScript II Green Fast Two-Step qRT-PCR Synthesis Kit)、熒光定量PCR試劑盒(2×RealStar Green Fast Mixture)等均購自北京GenStar康潤生物公司；蘇木精染液、伊紅染液、中性樹膠購自碧云天生物公司；一抗(Rabbit Anti-TLR2，Rabbit Anti-TLR4，Rabbit Anti-beta-Actin)、二抗(Goat Anti-rabbit IgG/HRP)購自北京博奧森生物技術有限公司；EDTA抗原修復緩沖液、自發(fā)熒光淬滅劑、牛血清白蛋白(BSA)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液、抗熒光淬滅封片劑染液購自武漢賽維爾公司.

1.2 方法

1.2.1 動物分組及組織收集 選用健康狀況良好、體重相似(270～290 g)的8周齡成年雄性Wistar大鼠30只.適應性飼養(yǎng)1 d后，將其隨機分為5組(n=6)，即對照組(CG)、38 ℃單次熱應激組(38 ℃-單激組，38 ℃-SHSG)、38 ℃多次熱應激組(38 ℃多激組，38 ℃-MHSG)、43 ℃單次熱應激組(43 ℃單激組，43 ℃-SHSG)、43 ℃多次熱應激組(43 ℃多激組，43 ℃-MHSG).對照組大鼠在溫度18～22 ℃、相對濕度30%左右條件下飼養(yǎng)，38 ℃單激組和43 ℃單激組分別在38 ℃和43 ℃智能人工氣候培養(yǎng)箱中(提供充足飲水)持續(xù)熱處理6 h，而38 ℃多激組和43 ℃多激組分別于每天中午12:00～14:00在38 ℃和43 ℃智能人工氣候培養(yǎng)箱中進行熱處理2 h，連續(xù)處理3 d，共計6 h.所有熱處理組其余時間的飼養(yǎng)條件與對照組一致.熱處理結束后，立即頸部脫臼處死所有大鼠，迅速采集各處理組脾臟組織，一部分組織樣品放入DEPC水處理過的1.5 mL凍存管后迅速投于液氮中，之后轉入-80 ℃冰箱保存，用于提取總RNA；另一部分放入4%的多聚甲醛溶液中固定后，用于包埋組織蠟塊.

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 各脾臟組織分別經(jīng)液氮迅速研成粉末后，用總RNA提取試劑提取組織總RNA，并經(jīng)DEPC處理水溶解.用超微量分光光度計(Nanodrop ND-2000, 美國Thermo公司)檢測總RNA濃度和純度，選取A260/A280=1.8～2.0的RNA樣品經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，選擇完整性好的RNA將其濃度調整為200 ng·μL-1，按照反轉錄試劑盒操作說明，合成第一鏈cDNA，并將其保存于-20 ℃冰箱用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR).

1.2.3 引物設計與合成 根據(jù)NCBI/GenBank數(shù)據(jù)庫中提供的大鼠TLR2、TLR4和β-actin基因的mRNA序列，使用軟件Oligo 6.0設計引物，并用BLAST對引物特異性進行檢測，引物由西安擎科澤西生物公司進行合成，相關信息列于表1.

表1 引物序列信息

1.2.4 qRT-PCR 按照熒光定量PCR試劑盒建議的方法，以優(yōu)化后的條件進行qRT-PCR擴增(以β-actin作為內參基因).反應體系為20 μL：上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL， 2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL， cDNA 0.4 μL， ddH2O 8.8 μL.采用優(yōu)化后的兩步法反應程序，即94 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)進行基因擴增.實驗結束后采集Ct值，采用2-ΔΔCt方法[12]進行目的基因表達量的計算.每個樣本設計4個重復.

1.2.5 HE染色 不同處理組脾臟組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，遞減濃度梯度酒精脫水后，用蘇木精染液染色5 min，1%的鹽酸-酒精分化液分化5 s，0.5%的伊紅染液染色2 min.然后在系列遞增濃度梯度酒精中脫水，并于二甲苯中透明,中性樹膠封片后，于光學顯微鏡(寧波舜宇顯微鏡)下觀察并拍照.

1.2.6 免疫熒光染色 石蠟切片經(jīng)二甲苯透明，遞減梯度酒精脫水后，置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(pH=9.0)中于微波爐內進行抗原修復.加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗后，滴加BSA室溫封閉30 min.甩掉封閉液，滴加稀釋后的一抗TLR2(1∶3000)和TLR4(1∶3500)后，放于濕盒內4 ℃孵育過夜.滴加與一抗相應種屬的二抗，室溫孵育50 min(避光).滴加DAPI染液，室溫復染10 min(避光).抗熒光淬滅封片劑封片后，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像.

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與結果分析 采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗，結果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著.

2 結果

2.1 不同熱應激條件下大鼠脾臟組織形態(tài)學比較

由HE染色結果(圖1)可知，在對照組的大鼠脾臟組織中，紅髓與白髓界限比較明顯，白髓較多，而在各處理組的大鼠脾臟組織中，紅髓與白髓界限不明顯，白髓所占比例減少，而紅髓比例增加.與38 ℃處理組相比，在43 ℃處理組中，白、紅髓界限更加模糊，脾竇嚴重萎縮，位于紅髓內的紅細胞數(shù)量明顯減少.與單激組相比，多激組中位于白髓和紅髓之間的邊緣區(qū)明顯變寬.

△ 白髓；☆ 紅髓；→ 脾竇；◇ 邊緣區(qū)

2.2 不同熱應激條件下大鼠脾臟中TLR2和TLR4基因表達水平

由qRT-PCR結果(圖2)可知，不同處理組大鼠脾臟中TLR2和TLR4 mRNA的表達趨勢相似.與對照組相比，TLR2和TLR4 mRNA表達量在38 ℃熱應激條件下上調，而在43 ℃熱應激條件下調.在38 ℃熱應激條件下，多激組中TLR2和TLR4 mRNA表達量低于單激組，而在43 ℃熱應激條件下，多激組中TLR2和TLR4 mRNA表達量高于單激組.這可能是由于43 ℃(相比38 ℃)超出了大鼠機體本身可調節(jié)的高溫閾值，對大鼠脾臟組織的免疫功能造成嚴重的損傷所導致，并且溫度越高、持續(xù)時間越長，這種損傷作用就越明顯.

2.3 不同熱應激條件下大鼠脾臟中TLR2和TLR4蛋白的陽性信號分布特征

由TLR2和TLR4蛋白的免疫熒光染色結果(圖3)可知，不同處理組脾臟組織中TLR2和TLR4蛋白的免疫陽性信號表達強度與mRNA表達趨勢類似：在相同處理組中，TLR4蛋白陽性信號(綠色)強于TLR2蛋白(紅色)；與對照組(圖3A2-A3)相比，38 ℃熱激組中TLR2和TLR4蛋白陽性信號明顯增強(圖3B2-B3,C2-C3)，而43 ℃熱激組中TLR2和TLR4蛋白陽性信號明顯減弱(圖3D2-D3,E2-E3).在不同處理組大鼠脾臟組織中，TLR2和TLR4蛋白陽性信號均定位于紅髓巨噬細胞的細胞膜上(圖3A2-E2,A3-E3).此外，對于TLR2蛋白而言，其強烈定位于對照組和38 ℃熱激組脾索中(圖3A2-C2)，并且與對照組相比，其在各熱激組中也定位于邊緣區(qū)巨噬細胞的細胞膜上(圖3B2-E2)；對于TLR4蛋白而言，其在各處理組中也定位于邊緣區(qū)巨噬細胞的細胞膜上(圖3A3-E3)，并且在對照組和38 ℃熱激組中也定位于白髓巨噬細胞的細胞膜上(圖3A3-C3).

A TLR2 mRNA相對表達量;B TLR4 mRNA相對表達量.內參基因:β-actin,n=4，不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)

A1～E1. DAPI核染(藍色);A2～E2. TLR2陽性細胞(紅色);A3～E3. TLR4陽性細胞(綠色);A4～E4. TLR2和TLR4陽性細胞的共定位;WpMΦ.白髓巨噬細胞;RpMΦ.紅髓巨噬細胞;MZMΦ.邊緣區(qū)巨噬細胞;SC.脾索

3 討論

熱應激可影響動物機體的免疫器官發(fā)育及免疫應答過程[13-15]，其對機體免疫功能的影響主要表現(xiàn)在淋巴細胞數(shù)量發(fā)生變化、巨噬細胞活性降低、免疫細胞群改變等方面[16]，但這種影響程度因熱應激條件的不同而存在很大差異.脾臟作為動物體最大的免疫器官，在免疫防御應答中扮演著十分重要的角色.Park等[14]通過比較轉錄組學研究發(fā)現(xiàn)，在熱應激條件下，雞(Gallusgallus)脾臟中許多與免疫應答和炎癥反應相關的信號通路被激活.Ma等[17]運用基于iTRAQ技術的蛋白質組學比較分析正常和熱應激肉雞脾臟中的差異表達蛋白質發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，熱處理組中與先天性免疫應答相關的差異蛋白表達下調.說明熱應激具有免疫敏感性，但不同熱應激條件下免疫相關基因的表達調控作用及免疫應答機理并不相同.動物器官、組織、細胞結構是其生理活動和功能運行的物質基礎，而組織形態(tài)學作為研究組織器官形態(tài)結構的常用方法和技術手段，是直觀、快速檢測外界刺激物對組織形態(tài)影響的最有效方法之一.為了明確熱應激對大鼠脾臟組織發(fā)育的影響，本研究基于HE染色對不同熱激組(38 ℃和43 ℃單激組、38 ℃和43 ℃多激組)脾臟組織形態(tài)學進行比較觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，各熱處理組大鼠脾臟組織中的白髓所占面積減小，而紅髓區(qū)域增多，位于紅髓中的脾竇萎縮，并且相比38 ℃熱激組，在43 ℃熱激組中脾竇的萎縮程度更加嚴重.這與何玉林等[18]在熱應激小鼠及Ren等[19]在冷應激鵪鶉脾臟中的組織形態(tài)學觀察結果相似，表明熱應激可導致大鼠脾臟組織形態(tài)結構發(fā)生改變，并且溫度越高，變化越顯著.此外，本研究發(fā)現(xiàn)，38 ℃和43 ℃多激組脾臟中的邊緣區(qū)明顯增加(與單激組相比).邊緣區(qū)處于白髓與紅髓的交界處，細胞排列疏松程度介于紅髓和白髓之間，由巨噬細胞、B細胞、T細胞等構成[20]，是脾內免疫應答的主要場所.說明與長時間持續(xù)性熱應激相比，短時間間隔性的熱應激可能對機體的免疫功能起到促進或改善作用.以上結果表明，由熱應激造成的大鼠脾臟組織形態(tài)學結構的改變可能是其免疫機能發(fā)生改變的主要原因，并且由于不同熱應激條件對大鼠脾臟組織形態(tài)學的影響不完全相同，因而對其免疫機能的影響也可能存在差異.

TLRs基因家族成員(如TLR2和TLR4)在免疫應答，尤其是獲得性免疫應答中扮演十分重要的角色，但是關于其在熱應激中的研究仍然很少，并且在熱應激過程中所發(fā)揮的分子生物學功能尚不明確.為了探究熱應激對大鼠脾臟中TLR2和TLR4表達模式及其生物學功能的影響，本研究首先通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TLR2和TLR4在38 ℃熱激組脾臟中的表達量上調.與此研究結果相一致，Quinteiro-Filho等[16]在肉仔雞上研究發(fā)現(xiàn)，與常溫組相比，TLR2和TLR4在熱激組(31 ℃)脾臟中的表達量上調.然而，本研究發(fā)現(xiàn)，在43 ℃熱激組大鼠脾臟中TLR2和TLR4的表達又出現(xiàn)顯著下調.這可能是由于不同強度的熱應激對動物機體免疫機能的影響不同所造成.強烈的熱應激可對機體的生長發(fā)育、免疫功能和抗疾病能力產(chǎn)生負面影響，而適度或輕微的熱應激可增強機體的免疫機能，進而提高對外界刺激的耐受性[21].黃長文[22]也研究發(fā)現(xiàn)，輕度的熱應激可促進大鼠脾臟源巨噬細胞的吞噬、殺傷和趨化作用，進而增強其免疫機能.由此推測，38 ℃的熱環(huán)境可能在大鼠可以承受的溫度范圍內，在此條件下，脾臟組織可通過上調TLR2和TLR4，進而激活由其介導的免疫相關信號通路，以應對熱應激對脾臟的損傷作用，但當溫度達到一定界限后，脾臟組織結構嚴重受損，尚不能通過免疫應答作用應對這種損傷，使得免疫相關通路被抑制甚至被破壞，從而導致脾臟中TLR2和TLR4表達量降低.此外，與對應的單激組相比，38 ℃多激組大鼠脾臟中TLR2和TLR4表達上調，而43 ℃多激組大鼠脾臟中TLR2和TLR4表達下調，這可能是由于在適度的熱應激刺激下，機體的免疫機能增強，并且免疫功能與刺激持續(xù)時間正相關，因而TLR2和TLR4的表達量隨著熱應激持續(xù)時間的延長而增加.然而，與其恰好相反的是，在劇烈的熱應激刺激下，由于脾臟組織嚴重受損，其所執(zhí)行的免疫功能也被嚴重破壞或抑制，因而TLR2和TLR4基因的表達下調，但與長時間持續(xù)性的熱應激相比，短時間的熱應激可以在一定程度上緩解其對脾臟免疫功能的損傷和破壞.

通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，TLR2和TLR4蛋白陽性信號的表達模式均與其mRNA基本一致，表明熱應激造成TLR2和TLR4基因在轉錄和蛋白水平發(fā)生了相似的表達變化特征.TLR2蛋白陽性反應分布于各處理組紅髓巨噬細胞膜上，并且在對照組和38 ℃熱激組的脾索及各熱激組邊緣區(qū)巨噬細胞膜上也有分布，而TLR4蛋白陽性反應分布于各處理組紅髓及邊緣區(qū)巨噬細胞膜上，并且也存在于對照組和38 ℃熱激組中的白髓巨噬細胞膜上.脾臟組織主要由3部分構成，即白髓、紅髓和邊緣區(qū)，每一部分都含有自己獨特的巨噬細胞群，在宿主免疫防御過程中發(fā)揮著不同的功能[23]，并且由于巨噬細胞具有“雙刃劍”作用，在不同的環(huán)境條件下被賦予不同的角色和使命.一方面，其可保護組織完整性，并且可吞沒、破壞受損傷的組織，修復組織損傷；另一方面，在某些條件下，也是組織的主要破壞者[24].由此可知，TLR2和TLR4基因可能作為膜型受體，主要參與調控大鼠脾臟巨噬細胞的免疫應答，并且在不同熱應激狀態(tài)下，不同的TLR2和TLR4基因表達模式使其介導的免疫應答過程及其機制不同，因而所發(fā)揮的免疫防御功能存在差異.在38 ℃熱激組中，熱環(huán)境可激活由TLR2和TLR4介導的相應的脾臟巨噬細胞免疫調控通路，進而增強機體的免疫防御機能；而在43 ℃處理組中，由于劇烈的熱環(huán)境使得脾臟原有的正常組織結構及生理功能明顯發(fā)生改變，因而免疫防御機能被抑制或破壞.但是，由TLR2和TLR4所介導的脾臟不同部位巨噬細胞應對熱應激的具體免疫應答分子機制尚需進行更深入的探究.