實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在嬰兒HIV感染早期診斷中的應(yīng)用

楊朝軍，董莉娟，陳會超，戴 潔，楊 敏，金曉媚，楊 莉，陳 敏

（云南省疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病防制所，云南 昆明 650022）

感染HIV的母親在妊娠、分娩或哺乳期間將HIV傳給嬰兒稱為垂直傳播或母嬰傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，如果不采取任何干預(yù)措施，艾滋病病毒的母嬰傳染率在15%～45%之間。如果在妊娠和哺乳期間盡早向母親和嬰兒提供抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，就可以降低直至消除母嬰傳播風(fēng)險(xiǎn)。被感染的嬰兒越早進(jìn)入治療，他的生存質(zhì)量越好。常用的嬰兒早期診斷方法為HIV核酸檢測，而核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)發(fā)展很快，目前，廣泛應(yīng)用的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time PCR，qPCR）。為此，作者對該技術(shù)在嬰兒早期診斷上的應(yīng)用開展了研究。

1 對象與方法

1.1 對象 調(diào)查對象為大理州和德宏州的感染艾滋病病毒的產(chǎn)婦所生的嬰兒。各級婦幼保健機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)收集相關(guān)信息，產(chǎn)婦需要簽署知情同意書，嬰兒在出生后1天、7天、21天、42天和3個月分別由醫(yī)務(wù)人員采血制備干血斑樣品，通過快遞寄到云南省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行檢測。

1.2 方法 ① 從干血斑樣品（DBS）中提取細(xì)胞基因組DNA。試劑為德國QIAamp DNA Mini Kit，操作步驟如下：打孔器打下3個直徑為6mm的干血斑，加入ATL緩沖液180μL，85℃水浴10 min；加入蛋白酶K 20μL，56℃水浴1小時(shí)；加入AL緩沖液210μL，70℃水浴10 min；加入無水乙醇200μL，混勻后轉(zhuǎn)移至分離柱，6000g 離心1 min；加入AW1洗液500μL，6000g 離心1 min；加入AW2洗液500μL，30000g 離心3 min；最后，加入洗脫液AE 50μL，6000g 離心1 min，得到核酸樣品。② 核酸樣品的擴(kuò)增和檢測。試劑為廣州海力特生物科技有限公司的人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）DNA定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。操作方法嚴(yán)格按照試劑說明書執(zhí)行，使用Applied BiosystemsTM7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增和分析。③ 嬰兒滿42天的干血斑用羅氏 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan 系統(tǒng)進(jìn)行HIV-1 核酸定性檢測。比較兩種檢測方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1 DNA定量檢測 2019年4月至2020年8月共對51例嬰兒進(jìn)行了采樣，其中3例嬰兒僅完成出生時(shí)的采樣，3例嬰兒完成3次采樣，2例嬰兒完成4次采樣，43例嬰兒完成5次采樣。共獲得235份干血斑樣品，采集情況見表1。經(jīng)HIV-1 DNA定量檢測，檢測結(jié)果低于檢測限。

表1 51例送檢嬰兒的干血斑采集情況統(tǒng)計(jì)

2.2 HIV-1 DNA定性檢測 45例嬰兒完成出生后42天干血斑的采集，用羅氏 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan 系統(tǒng)進(jìn)行HIV-1 DNA定性檢測，檢測結(jié)果低于檢測限。

2.3 用本實(shí)驗(yàn)室2012年采集的21例感染HIV的嬰兒的干血斑樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，嬰兒的采血時(shí)間為出生后1個月至15個月不等［1］，結(jié)果全部為HIV-1DNA 陽性，循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct）在14和23之 間，DNA的 平 均 值 為4428 copies/1×106cells（41-31157），詳見表2。

表2 21例感染嬰兒的熒光定量PCR檢測結(jié)果

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對干血斑的檢測結(jié)果 對51例送檢嬰兒的干血斑共235個樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果均低于試劑盒最低檢測限；對21例已知感染嬰兒的干血斑檢測結(jié)果全部為陽性，該方法的敏感性和特異性均為100%。

3 討論

由于暴露嬰兒體內(nèi)會攜帶來自母親的HIV抗體，該抗體最長在嬰兒滿18個月才會消失，所以，抗體檢測被各種早期診斷策略所替代。嬰兒早期診斷（Early infant diagnosis，EID）采用核酸檢測的方法，《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》（2015年修訂版）要求在嬰兒出生后6周及3個月進(jìn)行核酸檢測［2］。隨著相關(guān)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)及早治療可以減小病毒庫，因此在嬰兒早期診斷方面也在積極探索出生后及時(shí)進(jìn)行核酸檢測，出生時(shí)核酸檢測結(jié)果為陰性就可以排除宮內(nèi)感染。如果發(fā)生產(chǎn)時(shí)感染，需要在6周齡時(shí)再做核酸檢測［3］。本研究嘗試了在出生時(shí)和出生后7天和21天就進(jìn)行采樣檢測，并使用高靈敏度的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行DNA定量檢測，探索提早檢測的方法和策略。由于在研究期間，項(xiàng)目地區(qū)未發(fā)生母嬰傳播的個案，所有研究對象均檢測為陰性，并且與42天的定性檢測結(jié)果相一致，因此，新技術(shù)的應(yīng)用可以更早地排除感染，包括喂養(yǎng)過程中的感染。根據(jù)相關(guān)研究的進(jìn)展，《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》（2020年修訂版）也將首次采血的時(shí)間提早到出生后48小時(shí)內(nèi)。如果核酸檢測陽性，盡快再次進(jìn)行檢測，兩次檢測均陽性，就可以報(bào)告HIV核酸陽性。

嬰兒早期診斷使用的是干血斑樣本，該樣本沒有傳染性，可以室溫保存和運(yùn)輸，便于傳遞到區(qū)域中心實(shí)驗(yàn)室開展核酸檢測。本研究先提取HIV-1DNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，檢測下限為20 copies/1×106cells。以羅氏人類免疫缺陷病毒（1型）核酸檢測試劑（羅氏V2.0）的結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)［4］，廣州海力特人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）DNA定量檢測試劑的特異性為100%（235/235）；以嬰兒滿18個月HIV抗體的檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，廣州海力特試劑的敏感性為100%（21/21）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測暴露嬰兒的干血斑樣本，具有較高的敏感性和特異性，在嬰兒早期診斷領(lǐng)域具有發(fā)展?jié)摿Γ?］，為我國實(shí)施暴露嬰兒早期診斷的策略提供了一項(xiàng)技術(shù)性的支持。