犬血斑STR直接擴(kuò)增體系研究

錢 水，杜蔚安，劉超，楊前勇，葉俊華

（1.佛山市公安司法鑒定中心，廣東 佛山528000；2.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，廣州510000；3.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣州510080；4.公安部南昌警犬基地，南昌330100）

犬血斑STR直接擴(kuò)增體系研究

錢 水1,*，杜蔚安2，劉超3，楊前勇4，葉俊華4

（1.佛山市公安司法鑒定中心，廣東 佛山528000；2.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，廣州510000；3.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣州510080；4.公安部南昌警犬基地，南昌330100）

目的 構(gòu)建犬血斑DNA的直接擴(kuò)增體系。方法 依據(jù)犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增體系（包含基因座DAmel、PEZ1、PEZ2、PEZ3、PEZ5、PEZ6、PEZ8、PEZ12、PEZ15、PEZ20、PEZ21、FH2010、FH2054、FH2079、FH2132、FH2611以及VWFX），通過優(yōu)化PCR反應(yīng)組分和濃度，對(duì)犬血斑進(jìn)行直接擴(kuò)增，用ABI 3130遺傳分析儀檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果 16個(gè)STR基因座和1個(gè)性別決定基因座均得到擴(kuò)增，整體平衡，結(jié)果 穩(wěn)定。結(jié)論 優(yōu)化后的犬17 ASTR基因座熒光復(fù)合擴(kuò)增體系可以對(duì)犬血斑進(jìn)行直接擴(kuò)增。

犬；STR基因座；血斑；直接擴(kuò)增

STR復(fù)合擴(kuò)增分析現(xiàn)已成為犬個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的主要方法，在犬的檔案管理、遺傳育種及涉犬案件處理中發(fā)揮著重要作用[1-3]。

犬血斑是目前犬類鑒定最常見的樣本來源，但其含有許多抑制PCR順利進(jìn)行的成分[4]，如血紅素、血紅蛋白及載體雜質(zhì)等，因此在進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增前必須對(duì)犬血斑進(jìn)行DNA提取純化以除去其中的抑制成分，但這個(gè)步驟將至少需要2～3h，且過程繁瑣又極易污染，會(huì)耗費(fèi)大量人力物力，不適合大規(guī)模的DNA檢測(cè)分析。

本研究依據(jù)犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增體系，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)組分配方，成功克服了上述PCR抑制因素的影響，可無需經(jīng)DNA提取和純化處理便對(duì)犬血斑進(jìn)行直接擴(kuò)增和檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

80份犬血斑取自公安部南昌警犬基地，均在- 20℃保存。

1.1.2 主要儀器

MJ公司PTC200型溫度梯度PCR儀，ABI 3130遺傳分析儀。

1.1.3 主要試劑

犬17A STR熒光檢測(cè)試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，內(nèi)含2.5×Reaction Mix、5×DPrimers 17A、5U/μL的 熱 啟 動(dòng)C-Taq酶 和AGCU Marker SIZ-500），SSB（單鏈結(jié)合蛋白，上海晶天生物）和BSA（小牛血清白蛋白，羅氏生物）。全部試劑均為分子生物學(xué)級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血斑處理

于犬血斑兩邊浸透區(qū)域，用1.2 mm打孔器取下1片備用。同時(shí)采用Chelex-100法[5]提取基因組DNA作為對(duì)照。

1.2.2 PCR 復(fù)合擴(kuò)增

犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)體系采用25μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)設(shè)置，其中含有10μ L Reaction Mix（各組分反應(yīng)終濃度為10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.25 mmol/L dNTP Mix），5μ L DPrimers 17A引物混合物以及1μ L熱啟動(dòng)C-Taq酶，1片1.2 mm犬血斑樣本或2μ L犬基因組DNA，在反應(yīng)體系中加入不同濃度的SSB和BSA（表1），以水補(bǔ)充至25μL，充分混勻后短暫離心。

表1 反應(yīng)體系中SSB和BSA的反應(yīng)終濃度Table 1 Final concentrations of SSB and BSA in reaction solution

1.2.3 PCR 擴(kuò)增程序

95℃預(yù)變性2min；94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，共10個(gè)循環(huán)；90℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共20個(gè)循環(huán)；最后60℃延伸45min。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)及數(shù)據(jù)收集

擴(kuò)增產(chǎn)物10000 r/min離心1min，取1μ L加入到10μL上樣緩沖液中（內(nèi)含9.5μL去離子甲酰胺和0.5μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)AGCU Marker SIZ-500），振蕩混勻，在ABI 3130遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，使用GeneMapperv3.2軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分型。

2 結(jié)果

犬基因組提取的DNA，經(jīng)犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增常規(guī)體系擴(kuò)增可以得到完整分型，而血斑直擴(kuò)則完全得不到分型結(jié)果。但當(dāng)體系中同時(shí)加入SSB和BSA，隨著這兩種加入物質(zhì)的濃度不斷提高，血斑樣本各基因座的擴(kuò)增效率也逐漸提高。在SSB反應(yīng)濃度達(dá)4mg/mL、BSA的為0.3 mg/mL時(shí)，血斑的直接擴(kuò)增結(jié)果達(dá)最佳，各基因座分型均衡，整體效果與Chelex-100法提取的犬基因組DNA相當(dāng)（圖1）。不過，SSB和BSA濃度再增加，即便至6 mg/mL和0.6 mg/mL時(shí)，直擴(kuò)效果卻并不再有顯著變化。

圖1 1.2mm狗血斑隨不同SSB和BSA濃度增加的擴(kuò)增結(jié)果（提取的狗基因組DNA不加SSB和BSA的直接擴(kuò)增結(jié)果作為對(duì)照）Fig.1 Amplification of the 1.2mm-diameter dog's bloodstain with the addition of concentration-different SSB and BSA into its PCR reactions (controlled by the Chelex-100-extracted dog genomic DNA without addition of SSB and BSA)

因而，可確定犬血斑直擴(kuò)體系中SSB和BSA的反應(yīng)終濃度分別為4 mg/mL和0.3 mg/mL。按此對(duì)80份犬血斑進(jìn)行直接擴(kuò)增，結(jié)果顯示16個(gè)STR基因座和1個(gè)性別決定基因座均得到擴(kuò)增，且各個(gè)基因座擴(kuò)增均衡，無非特異性峰（圖2），與采用Chelex-100法提取的犬基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果沒有明顯差異。

3 討論

DNA提取和純化是STR復(fù)合擴(kuò)增除去PCR抑制劑的最常用方法。相關(guān)方法已多有報(bào)道[6]，市面上也有很多商業(yè)化的試劑盒，如Promega公司的DNA IQTM系統(tǒng)。但DNA提取純化是一個(gè)極其耗費(fèi)人力、物力的過程，而且還會(huì)增加樣本之間的污染。目前公安機(jī)關(guān)在建立犯罪人員DNA數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)均采用商品化的免提取直接擴(kuò)增試劑盒，但犬血斑DNA的直接擴(kuò)增罕有研究和報(bào)道。

犬血斑所含的血紅素、血紅蛋白和載體雜質(zhì)等非DNA成分會(huì)影響DNA聚合酶和模板DNA的結(jié)合，或者因其螯合Mg2+而使DNA聚合酶失去活性，從而阻止DNA新鏈[7]的合成。

根據(jù)上述抑制劑的作用機(jī)理，本研究在犬STR復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入單鏈結(jié)合蛋白SSB，由于它可以結(jié)合在DNA聚合酶復(fù)制叉前的單鏈區(qū)，從而防止新變性生成的單鏈DNA復(fù)性回雙鏈，而同時(shí)加入的BSA作為一種蛋白保護(hù)劑又能抵抗血紅素、血紅蛋白等雜質(zhì)對(duì)DNA聚合酶的抑制作用，而維持其熱穩(wěn)定性[4]，故在SSB和BSA這兩種添加劑最佳反應(yīng)濃度下，犬血斑直擴(kuò)的PCR抑制因素就被減弱或完全消除，保證了犬血斑免DNA提取的直接擴(kuò)增成功實(shí)現(xiàn)。

圖2 1.2mm某犬血斑按最佳條件直擴(kuò)的結(jié)果圖譜Fig.2 Genotype of one dog's 1.2mm-diameter bloodstain subjected to direct PCR amplification under optimal conditions

4 結(jié)論

本研究經(jīng)自主構(gòu)建犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增體系，并在其中加入SSB（終濃度4 mg/mL）和BSA（終濃度0.3 mg/mL），實(shí)現(xiàn)了犬血斑無需DNA提取的直接擴(kuò)增，整體均衡，結(jié)果穩(wěn)定。

［1］ 李英碧, 吳謹(jǐn), 侯一平, 等. STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用［J］. 法醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 21(2): 96-99.

［2］ 胡萌，姜成濤，葉健，等.犬3個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性研究［J］. 中國(guó)人民公安大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 2: 31-33.

［3］ K. De Munnynck, W. Van de Voorde. Forensic approach of fatal dog attacks: a case report and literature review［J］. Int. J. Legal Med, 2002, 116: 295-300.

［4］ A. Akane, K. Matsubara, H. Nakamura, et al. Identification of the heme compound co-purified with deoxyribonucleicacid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification［J］. J. Forensic Sci., 1994, 39(2): 362-372.

［5］ 公安部第二研究所編寫組.法醫(yī)物證檢驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用［M］ ．北京: 人民法院出版社, 1997: 333.

［6］ Burckhardt J. Amplification of DNA from whole blood［J］. PCR Meth. Appl., 1994, 3: 239-243.

［7］ Yamamoto Y, Shinozuka T, Kameyama H, et al. DNA typing with drop PCR kit for human blood［in Japanese］. DNA Polymorphism, 1999, 7: 75-78.

Direct Amplification of STRs from Canine Bloodstains

QIAN Shui1, DU Weian2, LIU Chao3, YANG Qianyong4, YE Junhua4
(1. Foshan Municipal Public Security Bureau, Foshan 528000, China; 2. Department of Forensic Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510000, China; 3. Guangzhou Institute of Criminal Science and Technology, Guangzhou 510080, China;
4. Nanchang Police Dog Base, Ministry of Public Security, Nanchang 330100, China)

Objective To establish a direct amplification system of STRs from canine bloodstains．Methods Based on canine 17A STR fluorescent multiplex amplification system consisting of the loci of DAmel, PEZ1, PEZ2, PEZ3, PEZ5, PEZ6, PEZ8, PEZ12, PEZ15, PEZ20, PEZ21, FH2010, FH2054, FH2079, FH2132, FH2611 and the VWFX, a sex determinant, the PCR was optimized at its reaction components and concentrations, and the STR genotypes of the dog's samples were detected with ABI 3130 Genetic Analyzer. Results All of the above 17 STR loci have been amplified with overall balance and reliance. Conclusion The optimal canine 17A STR loci fluorescent multiplex PCR system is capable of direct amplification for canine bloodstains.

canine; short tandem repeats (STRs);bloodstains; direct amplification

DF795.2

A

1008-3650(2016)04-0289-03

2015-09-21

格式：錢水，杜蔚安，劉超，等.犬血斑STR直接擴(kuò)增體系研究[J]. 刑事技術(shù)，2016,41(4):289-291.

10.16467/j.1008-3650.2016.04.008

錢水（1979—），男，湖南湘鄉(xiāng)人，碩士，主檢法醫(yī)師，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)物證。E-mail:qshui_jj@163.com