李亞楠， 朱蘊蘭， 陳宏偉， 王文斌， 方文艷

（徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221018）

0 引言

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）是一種珍稀藥食真菌，主要分布于芬蘭、波蘭、俄羅斯西伯利亞、日本北部，以及我國黑龍江省和吉林省等寒冷地區(qū)。樺褐孔菌屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬真菌，又名白樺茸、樺樹菇等，常被譽為“西伯利亞靈芝”。樺褐孔菌無任何毒副作用，具有抗腫瘤、降血糖、降血壓、抗病毒、增強免疫力、抗氧化、抗衰老、抑制病毒傳播、抗過敏、抗炎等作用[1-5]。樺褐孔菌的主要化學(xué)成分包括多糖、羊毛甾烷型三萜類化合物、多酚、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、栓菌酸、葉酸衍生物、芳香族物質(zhì)、單寧化合物、固醇類、生物堿類、黑色素類及木質(zhì)素類化合物等[6-9]。近年來，研究人員在樺褐孔菌多糖、萜類等主要活性物質(zhì)的提取、功能和深層發(fā)酵條件優(yōu)化，以及藥理作用和臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行了大量研究[10-16]。

樺褐孔菌作為藥食兩用真菌，已經(jīng)被制作成膠囊、針劑、糖漿、茶湯、坐浴劑、氣霧劑、調(diào)味品、面包、香腸、餅干、飲料、壓片糖果等的加工輔助品和食用色素原料等[17]。隨著環(huán)境質(zhì)量的不斷下降和快節(jié)奏生活壓力的增加，越來越多的人處于亞健康狀態(tài)，與此同時，由于人們對健康生活的需求而產(chǎn)生了眾多的功能性食品，功能飲料是其中最為常見的產(chǎn)品之一。目前，樺褐孔菌飲料品種單一、數(shù)量有限，本研究通過生物技術(shù)方法提取樺褐孔菌的活性物質(zhì)，優(yōu)化樺褐孔菌復(fù)合飲料配方，測定飲料的抗氧化能力，希望為豐富功能性飲料市場的產(chǎn)品種類、滿足特定人群的需求提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樺褐孔菌（Inonotus obliquus），購買于黑龍江大興安嶺森源山產(chǎn)品有限公司。

1.2 化學(xué)試劑

甲醇、苯酚、葡萄糖（天津市福晨化學(xué)試劑廠），濃硫酸（上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司），無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙酸乙酯（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），香草醛（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司），冰醋酸（西隴化工股份有限公司），高氯酸（天津市東方化工廠），異丙醇（上海建信化工有限公司），白樺脂醇（Sigma 公司），DPPH（源葉生物有限公司），以上均為分析純。白糖（徐州市綠然食品有限公司），明膠（福建中興食品配料有限公司），無水檸檬酸（福建中興食品配料有限公司），茉莉花茶（蕪湖市豐德林工貿(mào)有限責(zé)任公司），以上均為食品級。

1.3 試驗儀器

800Y 型高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司），DHG-9075A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上?；厶﹥x器制造有限公司），TU-1810 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），F(xiàn)A2104N 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），XO-SM100型超聲波微波協(xié)同反應(yīng)工作站（南京先歐儀器制造有限公司），L550 型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），ST16R 型低溫高速冷凍離心機（北京聯(lián)合科力科技有限公司），YXQ-LS-100A 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海東亞壓力容器制造有限公司），HH-4 型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），R201BL 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海電生科技有限公司），SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗流程

樺褐孔菌多糖和三萜類物質(zhì)提取流程如圖1 所示。樺褐孔菌飲料制備流程如圖2 所示。

圖1 樺褐孔菌多糖和三萜類物質(zhì)提取流程Fig. 1 Extraction process of polysaccharides and triterpenoids from Inonotus obliquus

圖2 樺褐孔菌飲料制備流程Fig. 2 Preparation process of beverage from Inonotus obliquus

1.4.2 樺褐孔菌多糖提取及含量測定

（1）樺褐孔菌多糖提取。將樺褐孔菌子實體在65 °C 條件下鼓風(fēng)干燥至恒質(zhì)量，粉碎后過40 目篩得到樺褐孔菌子實體粉末。準(zhǔn)確稱取5 g 樺褐孔菌子實體粉末樣品放入燒杯，按1∶40 的料液比加入蒸餾水200 mL，攪拌，用400 W 超聲波處理10 min，間隔10 s 共處理20 次，4 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液，在55 °C 條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮處理，得到樺褐孔菌粗多糖水提物，加入濃縮液4 倍體積的無水乙醇，搖勻，放于4 °C 冰箱12 h，8 000 r/min 條件下離心10 min，收集沉淀，用無水乙醇洗滌，將其放于60 °C 烘箱干燥至恒質(zhì)量，即得樺褐孔菌粗多糖。

（2）樺褐孔菌多糖含量測定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚?硫酸比色法測定。①葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。準(zhǔn)確稱取100 mg 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，在100 mL 容量瓶中定容，即得到濃度為1.0 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。吸取配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液10 mL，將其加入到100 mL 的容量瓶中定容，則制得終濃度為0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。取干燥具塞試管并1～6 標(biāo)號，依次精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)用液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 和1.00 mL （分別相當(dāng)于葡萄糖0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 和0.10 mg）置于試管中，補水至2.0 mL，再向試管中加入1.0 mL 5 %的苯酚溶液和10.0 mL 濃硫酸溶液，充分混勻，將其沸水浴2 min，充分冷卻，用蒸餾水于0 號管做相同處理為空白對照，在485 nm 波長處測定吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求回歸方程。②將提取的粗多糖溶于定量的蒸餾水中，吸取2 mL 按上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算多糖含量。

1.4.3 樺褐孔菌三萜提取及含量測定

（1）樺褐孔菌三萜的提取。與多糖提取條件相同，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，放于60 °C 烘箱干燥至恒質(zhì)量，得到水提粗三萜。

（2）樺褐孔菌三萜含量測定。以白樺脂醇為標(biāo)準(zhǔn)品，采取香草醛?冰醋酸?高氯酸分光光度法測定。①白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。準(zhǔn)確稱取白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，將其加到小燒杯中，加入少量的甲醇溶液攪拌使其完全溶解，倒入250 mL 的容量瓶中，加入甲醇溶液定容，搖勻，即得到40 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取干燥具塞試管并0～7 標(biāo)號，依次精確吸取白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20和1.40 mL（分別相當(dāng)于白樺脂醇0、8、16、24、32、40、48 和56 μg）于具塞試管中，沸水浴揮干溶劑，加入0.2 mL 新鮮配制的5%香草醛?冰醋酸溶液和0.8 mL的高氯酸，60 °C 水浴反應(yīng)20 min，冰水冷卻至室溫，再加乙酸乙酯定容至5 mL，搖勻，用0 號管做參比，在550 nm 波長處測定吸光值，以白樺脂醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求回歸方程。②將提取的粗三萜溶于定量的甲醇中，吸取1 mL，按上述白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光值，根據(jù)白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算三萜含量。

1.4.4 樺褐孔菌提取液制備

按1∶40 的料液比，在同1.4.2 節(jié)樺褐孔菌多糖提取的超聲與離心參數(shù)下，得到上清液，即樺褐孔菌提取液。

1.4.5 茉莉花茶提取液制備

準(zhǔn)確稱量4 g 茉莉花茶，沖泡于200 mL 的95 °C 水中，靜置5 min，即得到0.02 g/mL 的茉莉花茶水溶液，經(jīng)抽濾后得到?jīng)]有懸浮物的茉莉花茶提取液。

1.4.6 樺褐孔菌飲料配方單因素試驗

按流程方法制備飲料，選擇樺褐孔菌提取液添加量（20%、25%、30%、35%、40%）、白糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、明膠添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、檸檬酸添加量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、茉莉花茶提取液添加量（3%、4%、5%、6%、7%）的條件下，固定4 種因素添加原料的量，變化1 個因素進(jìn)行單因素試驗，采用感官評定方法對樺褐孔菌飲料感官指標(biāo)進(jìn)行評定。

樺褐孔菌飲料感官指標(biāo)評定標(biāo)準(zhǔn)如表1 所示。測定時隨機由10 人組成感官評定測試組進(jìn)行測定，表示為X±S。

表1 樺褐孔菌飲料感官評定標(biāo)準(zhǔn)Tab. 1 Sensory evaluation standard of Inonotus obliquus beverage

1.4.8 樺褐孔菌飲料配方多因素正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇樺褐孔菌提取液、白糖、明膠、檸檬酸、茉莉花茶提取液5 個因素，設(shè)定4 個水平，以感官評分為指標(biāo)進(jìn)行L16（45）的正交試驗，確定樺褐孔菌飲料的最佳配方。因素水平如表2 所示。

表2 正交試驗因素水平Tab. 2 Factors and level of orthogonal experimental

1.4.9 樺褐孔菌飲料的穩(wěn)定性測定

取適量樺褐孔菌飲料，在3 000 r/min 條件下離心30 min，將上清液稀釋10 倍，在610 nm 波長下測定離心前及稀釋后的吸光值，計算飲品的穩(wěn)定系數(shù)R。

1.4.7 感官指標(biāo)評定方法

1.4.10 樺褐孔菌飲料抗氧化能力測定

采用DPPH 自由基清除試驗來測定抗氧化功能。用無水乙醇配制0.1 mmol/L 的DPPH 自由基乙醇溶液，避光保存待用。參照文獻(xiàn)[18]方法，測定最佳配方制備的樺褐孔菌飲料DPPH 自由基清除率的具體試驗方法如下。以Vc 溶液作參比，量取最佳配方下獲得的樺褐孔菌飲料2 mL 及DPPH 溶液2 mL 加入到同一具塞試管中，充分搖勻，室溫下暗處避光靜置30 min 后，于517 nm波長處測定吸光度A樣品，同時測定樺褐孔菌飲料2 mL與無水乙醇2 mL 相同處理的吸光度A對照，以及蒸餾水2 mL 與DPPH 溶液2 mL 相同處理的吸光度A空白，均平行測定3 次，求取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌提取液多糖含量

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=8.924 4x1+0.022，R2=0.992 8，式中y為吸光值，x1為葡萄糖濃度（mg/mL）。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0～0.05 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好，可以用于樺褐孔菌提取液多糖含量的測定。

經(jīng)測定，樺褐孔菌提取液多糖濃度為2.5 mg/mL。

2.2 樺褐孔菌提取液三萜含量

三萜標(biāo)準(zhǔn)品白樺脂醇的回歸方程為y=0.008x2+0.020 7，R2=0.993 6，式中y為吸光值，x2為白樺脂醇濃度（μg/mL）。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明，白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品在0～56 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好，回歸方程可以用于樺褐孔菌提取液三萜含量的測定。

經(jīng)測定，樺褐孔菌提取液三萜濃度為0.248 mg/mL。

2.3 樺褐孔菌飲料配方單因素試驗結(jié)果

2.3.1 樺褐孔菌提取液添加量

在固定白糖添加量為8%、明膠添加量為0.3%、檸檬酸添加量為0.2%、茉莉花茶提取液添加量為4%的條件下，添加不同量的樺褐孔菌提取液，對樺褐孔菌飲料感官指標(biāo)進(jìn)行評定，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)樺褐孔菌提取液的添加量達(dá)到30%時，感官得分最高。樺褐孔菌提取液添加量少，飲料顏色較淺，滋氣味較為淡薄。當(dāng)樺褐孔菌提取液添加量超過30%時，樺褐孔菌飲料口感略微苦澀，顏色過深。

圖3 樺褐孔菌提取液添加量對飲料感官指標(biāo)的影響Fig. 3 Effect of amount of Inonotus obliquus extract on sensory indexes of beverage

2.3.2 白糖添加量

在固定樺褐孔菌提取液添加量為30%、明膠添加量為0.3%、檸檬酸添加量為0.2%、茉莉花茶提取液添加量為4%的條件下，添加不同量的白糖，采用感官評定方法對樺褐孔菌飲料進(jìn)行評定，結(jié)果如圖4 所示。當(dāng)白糖添加量達(dá)到8%時，感官得分最高。白糖添加量少，飲料甜味較為淡薄，酸甜不協(xié)調(diào)。當(dāng)白糖添加量超過8%時，樺褐孔菌飲料過甜。

圖4 白糖添加量對樺褐孔菌飲料感官指標(biāo)的影響Fig. 4 Effects of white sugar supplemental level on sensory indexes of Inonotus obliquus beverage

2.3.3 明膠添加量

在固定樺褐孔菌提取液添加量為30%、白糖添加量為8%、檸檬酸添加量為0.2%、茉莉花茶提取液添加量為4%的條件下，添加不同量的明膠，采用感官評定方法對樺褐孔菌飲料進(jìn)行評定，結(jié)果如圖5 所示。當(dāng)明膠添加量達(dá)到0.3%時，感官得分最高。明膠添加量少，飲料穩(wěn)定性差。當(dāng)明膠添加量超過0.3%時，樺褐孔菌飲料變得輕微黏稠和渾濁。

圖5 明膠添加量對樺褐孔菌飲料感官指標(biāo)的影響Fig. 5 Effects of gelatin supplemental level on sensory indexes of Inonotus obliquus beverage

2.3.4 檸檬酸添加量

在固定樺褐孔菌提取液添加量為30%、白糖添加量為8%、明膠添加量為0.3%、茉莉花茶提取液添加量為4%的條件下，添加不同量的檸檬酸，采用感官評定方法對樺褐孔菌飲料進(jìn)行評定，結(jié)果如圖6 所示。當(dāng)檸檬酸添加量達(dá)到0.2%時，感官得分最高。檸檬酸添加量少，飲料酸味較為淡薄，酸甜不協(xié)調(diào)。當(dāng)檸檬酸添加量超過0.2%時樺褐孔菌飲料變得過酸，酸味突出，口感差。

圖6 檸檬酸添加量對樺褐孔菌飲料感官指標(biāo)的影響Fig. 6 Effects of citric acid supplemental level on sensory indexes of Inonotus obliquus beverage

2.3.5 茉莉花茶提取液添加量

在固定樺褐孔菌提取液添加量為30%、白糖添加量為8%、明膠添加量為0.3%、檸檬酸添加量為0.2%的條件下，添加不同量的茉莉花茶提取液，采用感官評定方法對樺褐孔菌飲料進(jìn)行評定，結(jié)果如圖7 所示。當(dāng)茉莉花茶提取液添加量達(dá)到5%時，感官得分最高。當(dāng)茉莉花茶提取液添加超過5%時，飲料茉莉花茶的香氣過重，掩蓋住了樺褐孔菌特有的風(fēng)味。

圖7 茉莉花茶提取液添加量對樺褐孔菌飲料感官指標(biāo)的影響Fig. 7 Effects of jasmine tea extract supplemental level on sensory indexes of Inonotus obliquus beverage

2.4 樺褐孔菌飲料配方正交試驗結(jié)果

由表3 可知，各因素對樺褐孔菌飲料影響的主次順序是樺褐孔菌提取液（A）>檸檬酸（D）>白糖（B）>明膠（C）>茉莉花茶提取液（E）。樺褐孔菌飲料的最佳配方為A4B3C4D3E3，即樺褐孔菌提取液35%、白糖10%、明膠0.4%、檸檬酸0.2%、茉莉花茶提取液5%。但與表中試驗得分最高的10 號A3B2C4D3E1不同，因此再進(jìn)行驗證。根據(jù)配方A4B3C4D3E3和A3B2C4D3E1分別配制得到飲品Ⅰ和飲品Ⅱ，對二者進(jìn)行感官評價，結(jié)果如表4 所示。

表3 正交試驗結(jié)果與極差分析Tab. 3 Orthogonal test results and range analysis

表4 不同配方飲料的感官評分Tab. 4 Sensory scores of different formula drinks

由飲品Ⅰ最佳配方制備的樺褐孔菌飲料呈現(xiàn)焦糖色、澄清無沉淀，具有樺褐孔菌特有的風(fēng)味和清淡的茉莉花香味，無其他異味。

2.5 樺褐孔菌飲料穩(wěn)定性

對最佳配方制備的飲料進(jìn)行穩(wěn)定性測定，結(jié)果為穩(wěn)定系數(shù)R=98.56%，表明最佳配方制備的樺褐孔菌飲料穩(wěn)定性較好。

2.6 樺褐孔菌飲料的抗氧化能力

2.6.1Vc 對DPPH 自由基的清除率

按照試驗步驟進(jìn)行測定，測定結(jié)果以Vc 溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，DPPH 自由基清除率（%）為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖8 所示。

圖8 Vc 對DPPH 自由基的清除率Fig. 8 Scavenging rate of Vc to DPPH free radical

2.6.2樺褐孔菌飲料對DPPH 自由基的清除率

經(jīng)測定，最佳配方制得飲料對DPPH 自由基的清除率為52.12%，相當(dāng)于飲料中約含有6 μg/mLVc。

3 結(jié)論

樺褐孔菌提取液的多糖濃度為2.5 mg/mL，三萜濃度為248 μg/mL。樺褐孔菌飲料最佳配方為樺褐孔菌提取液添加量35%、白糖添加量10%、明膠添加量0.4%、檸檬酸添加量0.2%、茉莉花茶提取液添加量5%。樺褐孔菌飲料對DPPH 自由基清除率為52.12%。樺褐孔菌飲料呈焦糖色、澄清無沉淀，具有樺褐孔菌特有的風(fēng)味和清淡的茉莉花香味，無其他異味，具有較好的穩(wěn)定性和抗氧化活性，是一款具有較好市場發(fā)展前景的功能性飲料。本研究為豐富功能性飲料市場提供了依據(jù)。